クライオ

Nature Communications volume 14、記事番号: 1775 (2023) この記事を引用

1892 アクセス

15 オルトメトリック

メトリクスの詳細

頂端複合体は、マラリアやトキソプラズマ症を引き起こす病原体を含む、頂端複合体寄生虫の細胞骨格および分泌機構の特殊な集合体です。 その構造と運動メカニズムはよくわかっていません。 我々は、クライオFIBミリングとクライオ電子断層撮影法を使用して、突出状態と収縮状態の頂端複合体の3D構造を視覚化しました。 円錐形繊維の平均値から、それらの極性と、関連するタンパク質が繊維を接続し、安定化させていると思われる異常な9本のプロトフィラメントの配置が明らかになった。 コノイド​​繊維の構造も、螺旋状のコノイド複合体の構造も、突出または後退中に変化しない。 したがって、円錐は剛体として動き、以前に示唆したように、バネ状ではなく、圧縮可能でもありません。 代わりに、これまで硬いと考えられていた頂端極性リング (APR) が、円錐突起の際に拡張します。 我々は、突出中に円錐体とAPRを接続するアクチン様フィラメントを特定し、円錐体の運動中の役割を示唆した。 さらに、我々のデータは、円錐突起の際の分泌行為中の寄生虫を捕捉しています。

すべての細胞内病原体は、新しい宿主細胞に侵入する必要があります。 アピコンプレクサ類の寄生虫は、特殊な細胞骨格複合体と分泌細胞小器官で構成される侵入機構を使用します。 集合的に、このグループの細胞小器官は、頂端複合体として知られています。 アピコンプレックス門という名前はこの構造にちなんで付けられており、この門にはマラリア、トキソプラズマ症、クリプトスポリジウム症の原因物質が含まれています。 アピコンプレクサ寄生虫は、繊毛虫や渦鞭毛藻と同様、真核生物の肺胞上門に属します（補足図1）。 頂端複合体は、寄生虫の運動性と宿主細胞への侵入および宿主細胞からの退出に不可欠です。 さらに、頂端複合体機能を破壊する変異は、アピ複合体溶解サイクルをブロックし、それらを非感染性にします1、2、3、4。

頂端複合細胞骨格自体は、長さ約 250 nm (大腸菌の長さの約 25%) であり、コノイドと呼ばれる特殊なチューブリン繊維の中央螺旋の周りに組織された一連のリングで構成され、その内部に分泌小器官が組織されています。そして分泌の準備が整います（図1a）。 円錐形繊維は寄生虫の膜下微小管を構成するものと同じチューブリン二量体で構成されていますが、閉じた管を形成しません5。 代わりに、円錐状繊維は開いた「C」字型の構造を形成します5。 コノイド​​複合体は非常に動的です。寄生虫が付着因子やその他の運動性/侵入因子を分泌するときに、突起したり引っ込んだり 6 します 7、8。 注目すべきことに、頂端複合体にはチューブリンと繊毛関連タンパク質の両方が含まれているため、真核生物の繊毛から進化したようです9、10、11、12。 さらに、コノイドとその特殊なチューブリン構造を含む頂端複合体のコアは、頂複合体全体 13,14 および密接に関連する自由生活生物 15 だけでなく、渦鞭毛藻などのより遠縁な肺胞動物でも保存されています 16,17 (補足)図1）。 したがって、頂端複合体は古代の構造であると考えられますが、その分子組成、高分解能構造、およびその機能の機構的理解はまだほとんどが謎です。

突出状態と収縮状態を比較したコクシジウムの頂端複合体の構成要素の漫画概要。 この配色は原稿全体で使用されます。 b 断面方向にクライオFIBミリングされた部分的に後退した円錐形の断層写真では、SPMTがAADリングの近くで終わり、隣接するSPMTの間にAAD投影（紫色の矢印）が点在していることが明確に示されています。 c 隆起した円錐形を有する N. caninum の再構成された頂端の断層撮影スライス。 内膜複合体の 2 つの膜を接続する密度に注目してください (IMC、シアン色の矢印)。 その他のラベルやカラーリングについては下記をご覧ください。 d 突出円錐形からの頂端複合体の 3D セグメンテーションと視覚化 ((c) とは異なる断層像)。 特に断りのない限り、原稿全体で使用されるラベルと色: AAD (紫)、非晶質 APR 関連の密度リングと投影。 アクチン様フィラメント ((c) のマゼンタ)。 APR (赤)、頂端極リング。 CF（オレンジ）コノイドファイバー、ICMT（薄緑色）コノイド内微小管、IMC（シアン）内膜複合体、PCR（黄色）プレコノイダルリング、PM（灰色）細胞膜、SPMT（ダークグリーン）膜下微小管。 e（c）のように注釈が付けられた、収縮した円錐形を備えた、粉砕されたN.カニナムの再構成された頂端の断層撮影スライス。 f 収縮した円錐体の 3D セグメンテーションと視覚化 ((e) とは異なる断層像)、(d) のように色付けされています。 縦方向の図では、特に断りのない限り、原稿全体にわたって頂端は画像の上部に向けられています。 スケール バー: 100 nm (b ～ e)。

肺胞上門の共通の超微細構造特徴には、原形質膜のちょうど基底に位置し、肺胞として知られる細胞骨格に支えられた小胞構造が含まれます18。 アピコンプレックスでは、これらの構造は内膜複合体 (IMC) と呼ばれ、寄生虫の長さに沿って伸びています 19、20、21、22。 アピコンプレクサ類の寄生虫には、ミクロニームとロプトリーと呼ばれる 2 つの異なる特殊な細胞小器官があり、そこから侵入因子とエフェクタータンパク質が分泌されます (図 1a)23、24、25。 ロプトリの分泌には宿主細胞の原形質膜との密接な接触が必要ですが、ミクロニームは寄生虫が細胞外にいる間継続的に分泌すると考えられています。 これらの分泌細胞小器官は肺胞動物の間で広く保存されているわけではありませんが、最近の研究では、テトラヒメナやゾウリムシなどの繊毛虫では、ロプトリからの分泌がその構造とタンパク質成分の両方で保存されている複合体によって媒介されることが証明されています 26,27。

細胞クライオ電子断層撮影法（クライオ ET）は、分子分解能で構造の詳細を明らかにできる強力なイメージング技術ですが、生体サンプルの適切な厚さは数百ナノメートルに制限されています28。 ほとんどの無傷の真核細胞はこれより厚いです。 したがって、真核細胞全体のこれまでのクライオ ET 研究では、葉状仮足 29 や繊毛 30 などの自然に薄い細胞領域、または氷の薄い層に埋め込まれたために圧縮された細胞 (水の表面張力による圧縮力) のいずれかを画像化していました 31,32 。 厚い試料は、ナイフを使用した凍結水和切片作成（切断アーチファクトが発生しやすい 33）、またはクライオ集束イオンビームミリング 34 のいずれかによって、クライオ ET に十分な薄さにすることができます。

私たちは、おそらく世界で最も蔓延し成功した寄生虫であるコクシジウム アピコンプレックス寄生虫トキソプラズマ ゴンディと、その近縁種ネオスポラ カニナムにクライオ ET を適用しました。 私たちの研究では、厚い氷に埋め込まれた摂動されていない細胞のクライオ集束イオンビーム（クライオFIB）ミリングを主に使用して、ミリングされていない無傷の細胞の研究を悩ませていた圧縮や変形のアーティファクトを生じることなく、その場で突出状態と収縮状態のコクシジウム頂端複合体を比較しました。アピコンプレックスサンプル31、32、35。 当社の断層撮影による再構成により、頂端の複雑な構造の比類のないビューが提供されます。 円錐形繊維のサブトモグラム平均化により、一般的な仮説 5,35 に反して、円錐形はバネ状ではなく、突出と収縮のサイクル中に変形しないことを明確に示すことができました。 また、コノイドとコノイドが移動する頂端極性環（APR）の間に伸びるフィラメントも観察され、アクチンまたはアクチン様タンパク質の重合がコノイドの運動中に役割を果たしている可能性があることが示唆されました。 私たちのデータはまた、寄生虫の分泌細胞小器官と頂端の複合細胞骨格の間の相互作用についての前例のない見解を提供します。 最後に、我々は、無傷の原形質膜とミクロネームの融合の行為を捕捉することができました。 併せて、この研究は、頂端複合体の侵入機構である頂端複合体の構造的および機構の詳細を提供する。 この複合体はアピコンプレックス寄生虫感染に不可欠であるため、その機能の分子基盤を理解することで、世界で最も壊滅的な疾患のいくつかに対する治療介入のための重要な新たな標的が明らかになる可能性がある。

コクシジウムの細胞骨格は、界面活性剤抽出およびネガティブ染色後も非常によく保存されているようであり、このため、この調製方法を使用したアピコンプレクサの超微細構造の TEM 研究が数多く行われてきました 1,4,5,36。 まず、界面活性剤で抽出し、その後プランジ凍結したトキソプラズマ細胞のクライオ ET により、ネガティブ染色 (乾燥) サンプルの従来の TEM と比較して、細胞骨格構造の解像度が向上し、正確な 3D ビューが得られるかどうかをテストしました。 界面活性剤で処理したサンプルのクライオETでは、頂端円錐体や薄膜下微小管などの細胞骨格集合体が高コントラストで明らかになりますが（補足図2）、断層像には界面活性剤抽出によるアーチファクトや構造歪み（例、平坦化など）も示されています。補足図2e–h）は、これらのサンプルから信頼できる構造情報を取得することを複雑にしました。

したがって、混乱が最も少なく最高品質のサンプルを取得するために、比較的厚い氷の層（厚さ>1μm、水の表面張力による細胞の平坦化を避けるため）の中で、無傷で生きている寄生虫をプランジ凍結しました。 次に、クライオFIBミリングを使用して、ガラス化された、しかしそれ以外は天然の寄生虫の厚さ150〜200 nmのラメラを生成しました（補足図3）。 これらのサンプルを生成するために、ヒト病原体トキソプラズマ・ゴンディに密接に関連するBSL1微生物であるネオスポラ・カニナムのNC1株を使用しました（補足図1）。 細胞外寄生虫の円錐形は、宿主細胞の存在の有無にかかわらず、連続的に突出およ​​び収縮しますが、プランジ凍結の直前に、寄生虫を細胞内様緩衝液中で調製するか 37 、または 10 μM カルシウム イオノフォアとともに 10 分間インキュベートしました。 そのため、寄生虫の大部分は、円錐体の運動性や分泌などの細胞機能を妨げることなく、円錐体を、できればそれぞれ引っ込んだ状態または突き出た状態6で持っています。 得られた低温断層像は、膜、細胞骨格集合体、細胞小器官など、天然のN. caninum頂端複合体のよく保存された構造の詳細を明らかにします（図1および補足ムービー1）。

我々は、円錐形が突出した状態と引っ込んだ状態の 2 つの状態で、N. caninum の頂端複合体の構造を比較しました。 突出状態（図1c、dおよび補足ムービー1）では、前コノイドリング（PCR）は頂端細胞膜に最も近い細胞骨格構造であり（図1c、d）、その後に以下からなる関連コノイドが続きます。 14〜15個の円錐状繊維が螺旋状に配置されています（補足図2g、h）。 突き出た円錐形の状態と比較して、収縮状態の円錐形線維はAPRのちょうど基部に押し込まれ、PCRはAPR構造のわずかに頂端に位置します（図1e、f）。 突出した円錐体の基部にある内膜複合体（IMC）は、寄生虫原形質膜の直下に密度を伴う平らな二重膜構造としてはっきりと見えます（図1c、e）。 注目すべきことに、私たちのその場クライオETは、拡張されたシート状のIMCの2つの膜の間を橋渡しするいくつかの（非周期的な）密度を明らかにし（図1c、2cのシアン色の矢印）、おそらく距離を制限する「スペーサー」として機能します膜の間。 IMCシートの頂端縁は、頂端極リング（APR;図1c〜f）に取り付けられています。 IMCの直下では、約22の膜下微小管がAPRから基部に伸びています（図1b〜e）。 膜下微小管とそれに関連する微小管内部タンパク質（MIP）は、我々の凍結断層像ではよく分解されていますが、以前に詳細に分析されているため、ここでは焦点を当てませんでした 35,38。

超解像光学顕微鏡では、APR の成分が独立したリングに分離していることが示唆されています 39 が、これらのリングをネガティブ染色 EM で分解するのは困難でした。 私たちの断層像では、IMC の根尖縁近くのいくつかのリング状の構造を明確に分解できます。つまり、同様の直径を持つ 2 つの異なる APR、つまり、A1 リング (根尖) とより厚い A2 リング (基底) であり、これら 2 つは密接に構成されている可能性があります。積み重ねられたサブリングA2aおよびA2b（図2a、bおよび補足図2d、4a〜c）。 また、IMCと膜下微小管の先端の間に位置する非晶質密度のリング（ここでは「非晶質APR関連密度」またはAADと名付けられています）も観察されます（図1b〜fおよび補足図2aの紫色の矢印/構造）。 、d、4a–c)。 AADはAPRリングに接続されているようで、隣接する膜下微小管の間に挟まれた基底突起（幅21 nm、長さ64 nm）を持っています（図1b）。 AAD 予測は従来の EM 研究では報告されていませんでしたが、最近別のクライオ ET 研究で観察されました (参考文献 35 では「散在ピラー」と呼ばれます)。 突き出た円錐体と引っ込んだ円錐体の両方の状態の断層像で、APR、AAD リング、および AAD 投影を観察します。 興味深いことに、AADのリングと突起は、寄生虫の洗剤抽出中に保存されているようです（補足図2a、d、4a、b）。 この局在化と生化学的挙動は、AAD のリングと突起に IMC の頂端キャップの成分が含まれている可能性があることを示唆しており、最近、超解像光学顕微鏡によって微小管間に挟まれた状態で局在化していることが明らかになりました 4,40。 しかし、これらの研究では、ISP1 や AC9 などの既知の頂端キャップタンパク質は、APR から約 1 μm まで伸びており、AAD 投影が占める約 64 nm をはるかに超えています。 したがって、AAD リングと突起は、まだ同定されていない、または正確に局在化されていないタンパク質で構成されていると考えられます。

APR と IMC の構造を強調した、突出状態の頂端複合体の漫画。 b 断層撮影スライス (縦方向) には、2 つの異なる APR リング (赤い矢印) と、APR と IMC の間に位置する AAD リング (紫の矢印) が示されています。 c 断面断層撮影スライスは、2 つの膜の間に「スペーサー」密度 (シアン色の矢印) を備えた心尖端近くの IMC を示しています。 d、e 2 つの寄生虫から突き出た円錐状複合体の断層写真。 測定値は、IMC とコノイドの両側のコノイド ファイバー間の最小距離をマークします。 f、g 突出円錐台の基部の同じ領域の断層撮影スライス (f: オリジナル、f': 疑似カラー) と 3D セグメント化等値面レンダリング (g) は、円錐台間を接続する繊維状のアクチン様密度 (マゼンタ) を示しています。 (オレンジ) と APR (赤)。 スケールバー: 100 nm (b、d、e)。 50 nm (c、f)。

驚くべきことに、APR がコノイドを寄生虫膜に強力に固定する役割を果たすという考えとは対照的に、突き出たコノイドは断層像の APR に対して完全に正方形に見えることはありません (図 1c、d、2d、e の突き出たコノイドと引っ込んだコノイドを比較してください)図1e、fおよび補足図4d–f）。 代わりに、円錐形は、突出するにつれて、環状 APR に対して傾いて中心からずれる可能性があるように見えます。 この観察を定量化するために、断層像を通じて中央スライスの反対側からIMCの頂端縁と円錐台の基底端の間の距離を比較しました（図2d、eおよび補足図4d–f）。 突き出した状態（Δd = 52 ± 12 nm; n = 3）の断層像では、引っ込んだ状態（Δd = 10 ± 4 nm; n = 3）よりも対向距離の差が大きく変化することがわかりました。 これらのデータは、コノイドが柔軟でおそらく動的構造によって、APR および/または AAD を備えた IMC の頂端縁に「つながれている」という考えと一致しました。 実際、APR領域と円錐繊維の間にフィラメントが頻繁に観察されました（図1d、2f、g、および補足図4g–l）。

以前の研究では、アピコンプレクサの「滑走運動性」は、IMC 細胞骨格と寄生虫細胞膜の間のアクチン線維のトレッドミル運動によって駆動されることが示されています 41,42。 最近、F-アクチン ナノボディを使用して、アクチン線維が円錐体で核形成され、寄生虫が移動する際に伝達されることが実証されました 3。 IMC関連ミオシンネットワークへのハンドオフが起こると予想される場所の近くで、円錐形から伸びてAPR領域に接続するアクチン線維（直径約8 nm）と直径が一致しているフィラメントがはっきりと観察されます41,43。 これらのフィラメントは、断層像では長さが38〜164 nm（3つの断層像からn = 14の線維）であり、本質的に動的であることを示唆しています（図1d、2f〜g、および補足図4g〜l）。

無傷の寄生虫とは対照的に、洗剤で抽出したサンプルでは、​​陰性染色EM4、5、36によって同様に処理されたサンプルで通常見られるように、円錐形の基部はAPR上に直接座っているように見えます（補足図2a、4a、b）。 。 このギャップと糸状構造の崩壊は、APR とその円錐体への接続が、低温 FIB で粉砕されているがそれ以外は乱れていないサンプルで観察されるよりもはるかに堅いことを誤って示唆しており、これは再び現場分析の価値を強調しています。母国の構造物の様子。

以下で説明するように、コノイド繊維は、プロトフィラメントが開いた C 字型の断面を形成する珍しいチューブリン ポリマーです (補足ムービー 1)。 これらの繊維は当初「バネ状」構造の傷として説明され 5 、円錐体の動きはバネ状の機構によって駆動され、円錐構造の変形とその後の解放のサイクルが関与するというモデルにつながりました。 この仮説は、コノイド繊維が珍しい C 字型をしているため、より魅力的になります。これは、閉じた微小管よりも変形しやすく、圧縮しやすいと予想されます。 クライオFIBミリングが開発される前は、コノイドの電子顕微鏡やトモグラフィー分析には寄生虫膜の界面活性剤抽出や細胞の平坦化が必要でしたが、その結果、サンプル調製中や画像処理中に構造アーチファクトが発生することが多く、配向バイアスにより適切な処理が妨げられました。ミッシングウェッジ補正（補足図2a〜f、i）。 摂動のない天然の頂端複合体のデータにより、さまざまな機能状態における円錐状の超微細構造の変化に明確に対処できるようになります。

したがって、我々は、円錐体の動きが円錐体と円錐体繊維の変形を含むバネ状モデルに従って動作するかどうかを評価しようとしました。 我々は、コノイドポリマーの構造における全体的な超微細構造の変化は、コノイドの全体的な寸法および構造の変化をもたらすだろうと推論した。 凍結FIB加工したN. caninumの断層像で、突出円錐形と引っ込み円錐形の寸法を比較しました（図3および補足図5）。 頂端コノイド直径 (突出244 ± 19 nm vs 後退236 ± 8 nm)、基底直径 (350 ± 25 nm vs 326 ± 7 nm)、コノイド高さ (277 ± 5 nm vs 262 ± 13 nm) もありません。 nm）は2つの状態間で大きく異なりました（図3eと補足図5a）。 同様に、PCRに対するコノイドファイバーの角度、および隣接するコノイドファイバー間の間隔は、2つの状態で区別できませんでした（図3f-i）。 さらに、平均コノイド繊維長と母集団内の長さの分布の両方は、突出状態と収縮状態の間で有意な差はありませんでした（399±37nm対405±45nm;補足図6a）。

a – d' 頂端複合体の中心を通る断層撮影スライスは、突出状態（a）と引っ込んだ状態（b）の円錐体を示しています。 白い線は、円錐形構造の頂端直径 (a)、基底直径 (b)、および高さ (h) の測定値を示します。 (a、b) の白いボックスは、(c、d) で拡大された、コノイドと APR 関連複合体が相互作用する領域を示します。 (c' および d') は、(c および d) の擬似カラー バージョンで、図 1 で詳しく説明したように色付けされています。ミクロネムと内部の ICMT の間を追跡する細長いシート状の密度 (a と b の金色の矢印) に注目してください。円錐形。 IMC「スペーサー」密度は、(a、c) のシアンの矢印で示されています。 e 先端直径、基底直径、および突出（n = 3 の断層像、白いバー）および引っ込んだ円錐形（n = 3 の断層像、灰色のバー）の高さの測定では、突出と収縮のサイクル中に有意な変化は示されません。 f – i 突き出た状態（f）と引っ込んだ状態（g）の再構成された円錐形の端を通る断層撮影スライス（f、g）（縦断面の円錐形繊維を示す）。 線は、CF と PCR 面の間の相対角度の測定値 (突出状態の場合は n = 14 の測定値、収縮状態の場合は 13 回の測定値、赤線)、および隣接する CF 間の距離の測定値 (n = 24 の測定値) を示します。突き出た状態と引っ込んだ状態の 18 個の測定値、青い線)。 突き出た円錐形と引っ込んだ円錐形の後の測定結果をそれぞれ (h) と (i) に示します。 j – m の断層撮影スライスは、突出（j、k）および後退（l、m）状態の頂端複合体の断面図での代表的なPCR（jおよびm）およびAPR（kおよびl）を示しています。 APR と PCR の直径は、利用可能なすべての断層像からの範囲として示されています (両方の状態の APR については n = 3、n = 3 つの PCR が突出し、n = 2 つの PCR が引っ込められています)。 スケールバー: 100 nm (a、b、j – m)。 50 nm (c、d、f、g で)。 データは平均±標準偏差として表されました。 統計的有意性は両側スチューデント t 検定によって計算されました。 ns は有意ではありません (p > 0.05)。

コノイド​​が引っ込んだとき、コノイドの頂端と PCR は APR と同じ高さになりますが、コノイドが伸びた後は、コノイドの基部が APR の領域に位置します (図 3a、c、c を比較) ' 3b、d、d')。 突出状態と引っ込み状態の切り替えでは、頂端IMC領域、AAD、およびAPRはすべて、コノイドおよびそれに関連するPCR、および細胞膜に対する相対的な位置を変更します（図3a〜d'）。 我々の断層像では、APR と AAD の位置が IMC の頂端縁に密接に結合しているように見え、突き出た状態で頂端方向に曲がっているように見えます。 したがって、我々は、APR が円錐体の突出と収縮と相関する構造変化を示すかどうかを尋ねました。 各断層像でAPRの直径を測定し、突出状態と収縮状態でAPR直径が10〜30％顕著に増加したことが判明しました（図3k、lおよび補足図5b）。 APRとは対照的に、PCRとコノイドの構造は、2つの状態の間に観察可能な違いを示さなかった（図3j、mおよび補足図5c）。

次に、突出状態（図4a; 0.5 FSCで約3.0 nmの分解能、補足図6bを参照）と収縮状態（図4b; 0.5 FSCで約3.2 nmの分解能、補足図6bを参照）。 視覚的には、どちらの状態の円錐形線維のサブトモグラム平均もほとんど区別がつかないように見え、9つのチューブリンプロトフィラメント5と、線維を装飾する明確なタンパク質密度が明らかになります（図4a、b）。 2つの状態間の変動をより適切に評価するために、Chimera44を使用して、相関係数〜0.9でチューブリン二量体を2つの平均クライオETマップに当てはめました（図4c、d）。 次に、各状態からのコノイドファイバーの単一リピートの最適モデルを重ね合わせました（図4e）。 2 つの状態間でコノイド構造全体の形状に違いがないこと (図 3) と一致して、9 つのプロトフィラメント サブユニットのそれぞれは、データの分解能とフィッティングの誤差の範囲内で 2 つの状態間で区別できないように配置されているように見えます (図 3)。 .4e)。 オーバーレイで最も高いRMSDを持つ3つのプロトフィラメントサブユニット（PF5-7;補足図6c）は、平均のより低い解像度領域に適合していることに注意してください。

a、b 突出状態 (a) および引っ込んだ状態 (b) の CF ファイバーの平均 8 nm リピートの断面断層撮影スライス。 c – e チューブリンの高解像度構造は、突き出た状態（c、青）と引っ込んだ状態（d、ピンク）のサブトモグラム平均に適合しました。 突き出た状態 (青) と引っ込んだ状態 (ピンク) の 2 つの擬似原子プロトフィラメント モデルの比較 (e) に​​は、有意な違いは示されていません。 f 収縮状態の擬似原子プロトフィラメント モデルの縦方向の図。 ピッチは、隣接するプロトフィラメント間の周期的な CF 関連 MAP の上昇に基づいて推定されました。 g ナイスフォールド平均プロトフィラメントの等値面レンダリングは、円錐形の底面から見たときに「時計回りの歪み」を示し、円錐形繊維のマイナス端が底面に向いていることを示唆しています。 h CF 内のモデル化されたプロトフィラメントの配置 (ピンク) と、典型的な 13 プロトフィラメントの膜下微小管の高解像度クライオ EM 構造 (緑、EMDB: EMD-23870) と比較。 最も大きな違いは、PF4 と PF5 の間の角度の変化で、プロトフィラメントの配置に強いねじれが生じます。 i–k 断面（i: オリジナル、i': 擬似カラー）および縦方向（j およびk) 向き。 (i) の白い線は、各パネルのスライスの位置を示します。 ラベルとカラーリングは以下を参照してください。 l–o 等値面レンダリングは、平均 8 nm リピートを組み立てて完全なコノイド (n) からの CF だけでなく、断面 (l) および縦方向 (m) ビューでの平均 CF リピートの 3D 構造を示します。完全な断層像。 これと拡大図 (o) は、C 型 CF の開いた面が円錐体の内部に面していることを示しています。 ラベルとカラーリング: 1 ～ 9、プロトフィラメント。 IA (青) と OA (ピンク) の「内層アーム」と「外層アーム」の密度、IJ (黄) 内部接合、MAP。 MAP1 (オレンジ)、MAP2 (マゼンタ)、MAP4 (緑色)、微小管関連タンパク質。 スケールバー: 10 nm (a、b、i – k)。

まとめると、私たちのデータは、コノイドが立体構造的に変形可能な構造としてではなく、突出および収縮中に剛体として動いているように見え、このプロセス中にコノイド繊維内のプロトフィラメントの明らかな再配置が存在しないことを示しています。 しかしながら、これらのデータから、2 つの状態の間での軽微な構造変化を除外することはできません。 我々の現場データは、コノイド繊維が9本のプロトフィラメント5からなる珍しい開いたC字型の配置を形成しており、典型的な13本のプロトフィラメントMTとは異なる接触を必要とすることも裏付けている（図4h）。

コノイド​​繊維が突出状態と収縮状態の間で大きな構造変化を受けないことを実証したので、両方の状態の粒子を組み合わせてコノイド繊維の全体平均を計算しました（図4i〜k）。 得られた2つの状態の平均は、信号対雑音比が著しく改善され、0.5 FSC基準で〜2.8 nm（または0.143 FSC基準で〜2.2 nm、補足図6b）の分解能を示し、両方の密度コーティングを明らかにします。コノイド​​ファイバーの外部（MT関連タンパク質; MAP）および内部（MT内部タンパク質; MIP）エッジ（図4i-oおよび補足ムービー1）。 MIP密度は複数のプロトフィラメントを橋渡しし、コノイドファイバーの内面のほぼ全体をコーティングします（図4i、i'）。 これらの接触は、円錐状繊維構造の見かけの剛性を説明するのに役立つ可能性があります。 円錐形繊維の外表面も、ほぼ完全にMAPで装飾されているように見えます（図4i〜oおよび補足図2i〜k）。 PF5〜8に関連付けられているのは、ここでは「内層アーム」および「外層アーム」密度と呼ばれる2層のMAPです（IAおよびOA、図4i、jおよび補足図2i、j）。 追加の MAP には、PF1、2、および 4 にそれぞれ関連付けられた MAP1、2、および 4 が含まれます。 また、1つのコノイドファイバー（n）のPF3と隣接するファイバー（n + 1）のPF9を接続する内部接合MAP密度（IJ）も観察します。図4i、i'、k–oおよび補足図2i、i' 、k、6f–h）。 これらの繊維間の接触により、らせん円錐構造が安定化し、剛性が強化されると考えられます。 ほとんどのMAPは、コノイドファイバーの長さに沿って明確な8 nmの周期性を示します（図4j、k、mおよび補足図2j、k、6e、e'）。

通常の微小管は、特徴的な利き手、らせんピッチ、極性を持つらせん状の集合体です。 例えば、典型的な 13 プロトフィラメント微小管は、左巻き螺旋の回転 (「13-3 螺旋」) ごとに 3 つのモノマー (12 nm) の上昇、またはプロトフィラメントとプロトフィラメントの接触ごとに 0.92 nm の上昇を持つ直線ポリマーを形成します。 。 規則的に配置されたMAPをガイドとして使用して、縦方向のビューでコノイドファイバーのピッチを割り当てることができました（図4f、j、kおよび補足図2j、6e、e'）。 C 型のコノイド繊維は閉じた螺旋状微小管ではなく開いた微小管から形成されるため、プロトフィラメント間のピッチのみを計算しました。 私たちのモデルは、コノイドファイバーが典型的な微小管と同様に左手系の集合体を通じて形成されることを示していますが、プロトフィラメント間の推定ピッチは約1.5 nmであり、これは典型的な微小管よりも約1.6倍大きいです（図4f）および補足図6e、e'）。 コノイド​​ファイバーの構造極性を決定するために、プロトフィラメントの9倍の平均を実行しました(ファイバーのC型曲率の接線方向/法線を使用)。 9倍平均したプロトフィラメントの等値面レンダリングは、コノイド基部から見たときに「時計回りの歪み」を示し、コノイドファイバーのマイナス端がコノイド複合体の基部に位置していることを示唆しています（図4g）。

以前に報告された2つのPCR5、9の代わりに、3つのPCRを解決します（図5および補足図2b、7）：P1は最も頂端で最小のリングです（図5b–d、g、hおよび補足図7e）。 、i) 直径 151 ± 6 nm。これは、以前の界面活性剤で処理されネガティブに染色されたサンプルでは見落とされていた可能性があります。 P2（中央、図5b-hおよび補足図7f、j）は、次の直径を持つ2つのサブリングで構成されています：P2a-178±2nm、P2b-217±8nm。 そしてP3（基本;図5c、d、g、hおよび補足図7g、k）の直径は258±8 nmです（図5b–h）。 すべての直径は、4 つの異なるセル (n = 4) のリングの外側端で測定されました。 4つの再構成されたN.カニナム細胞からのPCRのサブトモグラム平均により、4.9 nmの分解能平均（0.5 FSC基準、補足図6b）が得られ、PCR層間の周期性と接続の両方が明らかになりました。 私たちの断層像では、各層は同じ周期性を持っているように見え、リングごとに45〜47のサブユニットがあります（図5g、h）。 P2とP3は、長さ約25 nmの規則的な間隔のリンカーで接続されており、隣接するリンカーサブユニット間に見かけの架橋密度があります（図5b〜d、gおよび補足図2b、7c）。

PCR の位置を強調した頂端複合体の漫画。 b – d 断層撮影スライス（bおよびc）、および接線方向（b）および縦方向（cおよびd）方向で表示された平均PCRリピートの等値面レンダリング（d）。頂端P1（強調表示）を含むPCRのさまざまなコンポーネントを示しています。青い矢印）、P2a（シアン）、P2b（緑）、P3（黄色）、および P2b と P3 の間のリンカー（オレンジ）。 (c) の白い線は、(b) のスライスの位置を示します。 e、f 生の断層像からの断面スライス (e) と平均化された PCR リピート (f) は、円形の PCR P2 リングが外側リングと内側リング、それぞれ P2a と P2b で構成されていることを示しています。 (e) の黄色の四角は、(f) に表示されるサブトモグラム平均の方向と位置を示します。 g、h 等値面レンダリングでは、平均化されたリピートを組み立てて完全な断層像を作成することにより、完全な PCR が表示されます。 スケールバー、20 nm (b、c、f)。 50 nm (e)。

化学的に固定され、樹脂に包埋されたアピコンプレクサ寄生虫の従来の EM は、コクシジウム コノイド内の頂端分泌細胞小器官の組織の基本的な概要を提供しており 5,46、我々はこれを使用して、頂端複合体の in situ 構造の分析をガイドしました。分泌小器官 - 私たちの断層像（図6、7、補足図8、および補足ムービー1）。 円錐形の先端から基部に500〜800 nm（図6a、bおよび補足図6i）延びる、円錐内微小管の中央対（ICMT）が明確に観察されます。これは、以前に報告された350 nmよりも長いです5。 ICMT は、コクシジウムの分泌のための主要な組織化中心であると提案されており 47,48、膜下微小管や円錐形線維の両方とは異なる一連の関連タンパク質を持っているようですが 5、現在までにそのようなタンパク質は 1 つだけ特定されています 49。

a、b 断層撮影スライスは、縦方向のビューで、突き出たコノイド複合体内の ICMT (緑色) の周りに組織化された分泌小器官を持つ N. caninum 細胞の頂端を示しています (a、a' - 突き出た元の擬似カラー、b - 引っ込んだ状態) ）。 長い ICMT は円錐体の頂点をサイトゾルに接続し、分泌小胞 (水色) および 2 つのロプトリ (バラ色) と密接に共局在しています。 膜に関連する最頂端の小胞は、（a）に示す断層撮影スライスでは見えませんが、パネル（c、d）および図7bでは見えることに注意してください。 その他の色: CF (オレンジ)、ミクロニーム (濃青色)、シート状密度 (金色)、小胞間接続 (ピンク)、ICMT の頂端マイナス端を覆う「クラウニング」密度 (紫)。 c – e（それぞれaとb）に示されている断層像の3Dセグメンテーションと視覚化、つまり、突出したコノイド（c、d）と引っ込んだコノイド（e）を備えており、CFを含むコノイド複合体内の分泌小器官の全体的な組織を示しています（内部の内容物を示すために正面からトリミング）、ミクロニーム、ロプトリー、ICMT、小胞、小胞間接続、ミクロニームに沿ったシート状構造、および細胞膜（灰色）。 d は、(c) の拡大図を示していますが、わかりやすくするために円錐状の繊維は隠されています。 f、g (a および b) に示す断層像からの突出円錐体 (f、f' - 元のおよび擬似カラー) および引っ込んだ円錐体 (g) の断面スライス。 スケールバー: 100 nm (a、b)。 50 nm (f、g)。

a-c' 断層撮影スライス (a-c: オリジナル、a'-c': 疑似カラー) は以下を示します: (a、a') 5 つの規則的に間隔を置いた小胞 (水色)、そのうち 4 つは微小管の 1 つに沿って追跡しています。 ICMT (薄緑色) と小胞間リンカー (ピンク) によって接続されています。 (b、b') 最頂端小胞 (水色) および「ロゼット」ドッキング複合体 (黄色) を介して細胞膜 (PM) と相互作用するロプトリー (バラ)。 （c、c'）ロプトリネック領域のロプトリ膜に関連する螺旋状の足場（ダークローズ）。 d、e サブトモグラムのスライスは、断面 (d) および縦方向 (e) 方向で見た ICMT の平均 8 nm リピートです。 f 場合によっては、ICMT 複合体で 2 つ以上の微小管が観察されました。 ここでは 3 つの微小管 (白い矢印) の例を示します。 g 界面活性剤で抽出されたトキソプラズマ細胞の 53 個のサブトモグラムからの 13 倍の回転平均 ICMT。 矢印は、ICMT を頂端から基底に向かって見たときのプロトフィラメントの時計回りの歪みを示し、ICMT のマイナス端が寄生虫内で頂端に向いていることを示します。 h、h' ICMTの基底端は、フレア状の端と異なる長さのプロトフィラメントを示し、これは通常MTの動的プラス端に関連しています。 i 突出した円錐体の断層スライスは、ミクロネームの組織を示しています。 挿入図: 25 個のミクロネームの頂端のサブトモグラムの平均は、平坦で電子密度の高いキャップを示しています。 j、k の断層撮影スライスは、隣り合ってドッキングされている 2 つの分泌細胞小器官、ミクロネーム (M) とロプトリ関連小胞 (V) の側面図 (j) と上面断面図 (k) を提供します。細胞膜（ロゼットを通る小胞（Ro））ですが、明確なドッキングサイト（44 nm離れています）があります。 両方の細胞小器官が同じ細胞膜に固定された隆起（黄色の矢印）につながれていることに注意してください（ピンクと青色の矢印）。 (j) の白い線は、(k) のスライスの位置を示します。 スケールバー: 100 nm (I); 50 nm (a ～ c​​、f、h、j、k 内)。 20 nm (i インサート内)、10 nm (d、e、g 内)。

樹脂包埋サンプルの EM で観察されたこと 5 と一致して、突き出た円錐形と引っ込んだ円錐形の両方の断層像で、異なる分泌細胞小器官 (ロプトリとミクロネーム) が ICMT の反対側に分離していることが観察されます (図 6)。 また、以前の報告と一致して、ICMTの微小管の1つに沿って追跡する4〜6個の規則的な間隔の小胞も観察されました（図6a〜e、7a、a'）。 我々は、最近記載された「ロゼット」の密度にドッキングしているように見える、ICMTのちょうど頂端にある単一の小胞を観察し（図7b-b'）、ロプトリ分泌の促進と関連している26。 この機能と一致して、最も頂端の膜にドッキングした小胞が1〜2つのrhoptriesの頂端に接続していることが観察されます（図7b、b'および補足図8a）。 また、小胞をICMTの両方に接続する明確な密度、および鎖内で小胞を相互に接続する明確な密度も特定しました（図6a〜e、7a）。 注目すべきことに、膜にドッキングした頂端の小胞ではこの架橋密度が観察されませんでした（図7a;小胞鎖と頂端小胞が存在するn = 6の断層像。他の断層像では、頂端小胞が低温で粉砕されていることに注意してください） FIB）。 頂端小胞は ICMT に関連する小胞鎖に由来すると考えられますが、ロプトリおよび細胞膜とドッキングすると、小胞鎖とその接続から解放されたと考えられます。 また、小胞の一部がICMTの軸に沿って細長く見えることも観察しました。これは、小胞が張力を受けており、ICMTに沿った活発な輸送で捕捉されたことを示唆しています（図6a）。

寄生虫の細胞には約 10 のロプトリと数十のミクロネームがありますが、いつでもどちらかの細胞小器官のサブセットだけが寄生虫の円錐形にドッキングします 46。 寄生虫円錐体の全直径を含むすべての断層像（9 つの断層像のうち 6 つ）では、ICMT に沿って追跡する 2 つのロプトリが観察されましたが、ICMT の反対側にありました（図 6c-g; 色のバラ）。 しかし、rhoptries を ICMT に接続する明確なリンカーは観察されません。 寄生虫の頂端領域内では、らせん状の密度コークスクリューがロプトリー膜に沿って回転しており（図7b-c'）、免疫EM50で見られるFerlin-2の局在パターンを彷彿とさせます。 円錐形内でロプトリを螺旋状に巻き上げているフィラメントは、寄生虫が表面張力により平らになっている未粉砕サンプルの断層像から、直径が約 33 nm、ピッチが約 21.5 nm であると以前に推定されていました。 このような予測されたらせんは、凍結FIB粉砕寄生虫からの直径約36 nmおよびピッチ約17 nmの測定結果と一致することがわかりました（図7c、c'）。

それらの長さが短く、その長さに沿って関連タンパク質が変化する可能性があるため、ICMT のサブトモグラム平均化では、MAP または MIP を明確に分解するのに十分な分解能が得られませんでした（図 7d、e）。 代わりに、界面活性剤で抽出された断層像からの ICMT サブ断層像の平均を使用して、ICMT 断面のキラリティーを調べました 52 (図 7g)。 この分析は、円錐繊維とは異なり、対の ICMT の両方が、そのマイナス端が頂端を向いていることを示しています。 さらに、ICMTペアの基底のプラス端は、動的微小管に典型的な広がった形態を示します（図7h）。 この観察は、他のほとんどのアピコンプレックス型MT構造とは異なり、ICMTがそのプラス端で動的不安定性を示すことを示唆しており（図7h）、以前に報告されたICMTの長さがサンプル間で大きく異なり、抽出されたサンプルでは一貫して短い理由を説明する可能性があります5。無傷の在来の寄生虫から測定したものです。 また、ICMTの頂端のマイナス端を覆う密度も観察されます（図6a、b）。これは、ICMTが重合している微小管組織化中心と一致すると考えられます。 しかし、コクシジウムでは、γ-チューブリンは寄生虫の中心小体と細胞質に限定されているようで、頂端複合体には局在していないようです53。 以前に報告されているように 46、一部の ICMT には 3 番目の微小管が含まれており (図 7f)、その機能には構造の厳密な制御が不要であることが示唆されています。

注目すべきことに、ICMTとそれに関連する小胞およびロプトリは、ミクロネームが占める領域とは異なる円錐体の片側に分離しています（図6c〜g）。 したがって、ICMT は分泌のためのミクロネームの組織化には直接関与していません。 それにもかかわらず、ミクロネームは混乱しているようには見えません（図6c〜e、7i）。 代わりに、それらはクラスター状に配列され、明確な分極方向を示します。 ミクロネームは長さ（220±30 nm）と幅（58±11 nm、補足図8b–h）が比較的均一で、基底端は丸いのに対し、頂端は平らで電子密度の高いキャップで狭く見えます。 (図7i;挿入図)。 この密度は、我々が提案する未記載の足場複合体がミクロニームを組織し、その輸送を支援していることを示唆しています。 さらに、収縮した円錐体の1つの断層像では、頂端を通して細胞膜とドッキングしているように見える2つのミクロネームが観察されました（補足図8i）。 さらに、我々は断層像においてミクロネームとICMTの間に長いシート状の密度を一貫して特定しました（図6a、bおよび補足ムービー1）。 シートは厚さが約 4 ～ 8 nm の間で変化し、繊維状に見え、幅は約 15 ～ 30 nm で、多くの場合、円錐形の上部から底部の下まで伸びるように追跡できます。 これらのデータは、シート状構造が分泌小器官の組織化と輸送を支援している可能性があることを示唆しています。

ミクロニームは細胞外寄生虫の運動性を促進するために継続的に分泌する一方、宿主細胞侵入の誘発にも密接に関与しています。 宿主細胞への侵入を開始するために、すべてのアピコンプレクサ寄生虫は、ミクロネームタンパク質（AMA1）とロプトリタンパク質（RON2）を含む受容体/共受容体ペアの分泌に依存しています54,55。 侵入装置のミクロネームとロプトリの構成要素は、円錐体で共通の経路を通って分泌されるときに混合すると提案されています23。 停泊しているロプトリーからミクロニームが分離されているのが観察されたということは、このモデルに疑問を投げかけています。 さらに、突出した円錐体の1つの断層像で、細胞膜のドッキング/分泌の過程で捕捉されたと思われるミクロネームを特定しました（図7j、k、および補足図8j–m）。 進行中の分泌イベントと一致して、問題のミクロネームは、測定された他のすべてのミクロネームの長さの約半分です（補足図8h、赤いデータポイント）。 直径約85 nmの円形領域内の1つの大きなまたは複数の接触サイトと一致する密度が観察されます（図7kおよび補足図8j、l）。 また、ミクロネーム内容物の分泌と一致して、接触部位に関連する原形質膜の表面に明らかな密度の塊が観察されます（図7jおよび補足図8j、m）。 注目すべきことに、この分泌ミクロネームのドッキング部位はロゼットおよびそのドッキングされたロプトリ/頂端小胞から44 nmにあり、2つの細胞小器官が異なる分泌機構を使用して別々の部位で分泌していることを示しています（図7j）。 ただし、ロプトリ関連小胞とドッキングしたミクロネームの両方は、同じ尾根（図7j、k、および補足図8j;黄色の矢印）と膜アンカー（補足図8mおよび挿入図;黄色の矢印）につながれています。おそらく分泌の空間的および時間的調整を促進すると考えられます。

頂端複合体の円錐構造は、従来の TEM による初期の記述以来、顕微鏡学者の想像力を魅了してきました 56,57。 ここでは、我々は、クライオFIB粉砕寄生虫にクライオETを適用し、円錐形の突出状態と収縮状態におけるコクシジウムの頂端複合体細胞骨格および関連する分泌細胞小器官のネイティブなin situ構造を比較した。 円錐状の突起は、光学顕微鏡で確認できる寄生虫の先端の顕著な形態学的変化と関連しています6,58。 これらの形態学的変化は、円錐体の珍しい螺旋形状と相まって、円錐体がバネ状であり、その運動（突出/収縮）中に変形するというモデルをもたらしました。 界面活性剤で抽出された寄生虫の以前のクライオ EM 59 と最近発表されたクライオ ET 分析 35 では、突出する円錐形と引っ込む円錐形の違いが記録されています。 ただし、Sun et al. のサブトモグラムの平均化は行われません。 研究は洗剤で抽出されたサンプルに焦点を当てており、以前の両方の分析で使用されたサンプルは圧縮されており、構造的なアーチファクトを引き起こす可能性があります。

対照的に、私たちのクライオFIB粉砕サンプルは、コクシジウムの頂端複合体構造の円形性を保存しており（補足図2g、hおよび補足ムービー1）、そのネイティブ構造のより信頼性の高い調査が可能です。 我々のデータは、円錐体の突出状態と収縮状態の超微細構造と分子組織の両方が区別できないことを示しており、これは円錐体の繊維が円錐体の運動中にバネのように変形せず、したがって円錐体の運動や運動を補助するエネルギーを提供しないことを示しています。分泌。

収縮した円錐体と突き出た円錐体の構造の変化は観察されませんでしたが、APR は突出中に拡張するように見え、これは突出中の心尖端での IMC の屈曲と連動して現れることがわかりました。 また、コノイドとAPRの間の密接な接触は観察されず、むしろ、コノイドをAPRおよび/または先端縁に接続する柔軟なおよび/または動的なテザーと一致して、突き出たコノイドはAPR平面に対してやや傾いているように見えることがよくあります。 IMC。 RNG2 は、その N 末端と C 末端が突出中にコノイドと APR の間にまたがるように見えることから、そのようなタンパク質の 1 つであると考えられます 60。 このような本質的に無秩序なタンパク質の密度を特定することは期待できませんでしたが、突出コノイドの基部とAPRの間に広がる密度はアクチン/アクチン様フィラメントと一致することを観察しました。 したがって、この部位でのアクチン重合が円錐運動の力の生成に少なくとも部分的に関与している可能性があります。 注目すべきことに、円錐突起の初期の記述では、サイトカラシン D によるアクチンの解重合が円錐突起を減衰させるものの、完全にはなくならないことがわかっています 6。 最近、コノイドでのアクチンの重合に関与するフォルミン-1 がコノイドの突出に必須であることが証明されました 61。 それにもかかわらず、個々のタンパク質を頂端複合体に配置し、コノイドの動力学と機能の物理的基盤を解明するには、遺伝的摂動を使用したさらなる高解像度の構造研究が必要となるでしょう。

凍結FIB粉砕サンプルは寄生虫の膜を保存していたので、頂端複合体の細胞骨格と寄生虫の特殊な分泌細胞小器官との間の相互作用に関する比類のない観察が得られました。 我々は、ICMTと寄生虫ロプトリおよび頂端小胞鎖の両方との間の密接な接触を観察した。 これは、ICMT がこれらの細胞小器官の組織化に関与しているが、直接の接触が観察されていないミクロニームの組織化には関与していないことを示唆しています。 興味深いことに、ICMTはEucoccidiorida以外のアピコンプレクサでは広く保存されていませんが、アピコンプレクサに最も近縁な現存生物の1つである自由生活性肺胞生物であるクロメラ・ヴェリア15では一対のICMTが報告されています（補足図1）。 したがって、ICMT は祖先種に存在していた可能性があります。 寄生虫のキネシンとダイニンはICMTに局在していないが、頂端小胞とロプトリーがICMTに沿って移動するということは、微小管モーターがそれらの組織化を促進している可能性があることを示唆している。 アピコンプレックスの輸送の大部分はアクチンフィラメント上で起こると思われるため、寄生虫の微小管モーターはまだ体系的に特徴付けられていません。 注目すべきことに、これまでに単一のICMT局在タンパク質のみが同定されており49、既知の構造との明確な相同性を欠いている。

この分野での主要な未解決の問題は、頂端複合体にドッキングしている浸潤に関連する細胞小器官の分泌を駆動する力の分子基盤である。 ロプトリの長さは 1 μm を超えており、分泌を促進するには単純な膜ドッキングよりも複雑な機構が必要と考えられます。 興味深いことに、サイトカラシン D を使用したアクチンの解重合は、寄生虫の運動性と侵入をブロックしますが、宿主細胞の付着とロプトリ分泌はブロックしません 65 。これは、アクチンが分泌の駆動に関与していないことを示唆しています。 最近の研究により、アルベオラータの繊毛虫グループで最もよく特徴づけられる構造である「頂端ロゼット」を構成するアピコンプレクサ Nd タンパク質が同定されました 27。 繊毛虫における役割と同様に、アピコンプレクサの Nd タンパク質はロプトリ分泌に必須であり 26、ロゼット構造は最近、粉砕されていない寄生虫のクライオ ET を使用して説明されました 51。 トキソプラズマタンパク質 Ferlin-2 もロプトリの分泌に必要であり 50、我々や他の研究者ら 51 は、公表されている Ferlin-2 免疫 EM 染色パターンを彷彿とさせる、コノイド内のロプトリの周りに螺旋を描く密度を特定しました 50。 これらのらせん状のフィラメントは、分泌中にロプトリを絞るためにダイナミンのように機能する可能性があります。 トキソプラズマ Nd 関連タンパク質の中には、推定上の GTPase 関連タンパク質が含まれており 26 、ダイナミン様活性がこの部位にも存在する可能性があることが示唆されています。

急速に凍結し、非常に動的な細胞プロセスのスナップショットをキャプチャする能力により、分泌過程にあると思われるドッキングされたミクロニームを観察することができました。 我々は、ミクロネームの分泌部位が、ドッキングしたロプトリ関連小胞の部位とは異なることを発見し、これら2つの細胞小器官によって分泌される浸潤機構の構成要素が、分泌後に頂端細胞膜で互いに見つけ合う必要があることを示唆している。 私たちのデータは、ミクロネームの分泌が円錐突起の際に起こる可能性があることを示しており、この現象は他の研究によって間接的に相関している7。 ただし、これらのデータは、収縮状態での追加の分泌を除外するものではないことに注意してください。 最後に、ドッキングした微小語名とロプトリ関連小胞の間の原形質膜に関連した隆起とアンカーだけでなく、微小語名と ICMT の間を追跡する細長い (繊維状) シートも観察しました。 これらの構造は、頂端分泌細胞小器官の組織化、輸送、および調整された膜ドッキングに関与する細胞骨格要素を表す可能性があります。 ミクロネームの代謝回転にはアクチンに沿った輸送が必要ですが、ミクロネームの生合成と組織化はアクチンに依存しないように見えます 63。 アンカー、リッジ、シートの分子成分と、細胞小器官の輸送と分泌におけるそれらの機能を特定するには、さらなる研究が必要である。

要約すると、クライオFIB粉砕寄生虫のクライオETにより、薄い氷層で無傷の細胞を調製するときに発生する圧縮アーティファクトを克服して、その場で頂端複合体を検査することが可能になりました。 これらの重要な進歩により、コノイド複合体の本来の構造と、収縮および突出時のその動きを調べることが可能になりました。 我々は、コノイドが突出中に剛体として移動し、糸状のアクチン様突起がコノイドをAPRに接続していることを明確に実証することができた。 頂端複合体の機構を理解するための次のフロンティアは、宿主細胞の侵入中に寄生虫を捕捉することになるでしょう。 寄生虫が宿主細胞膜と密接に接触すると、頂端複合体の構成要素が何らかの構造変化を受ける可能性があります。 また、プロテオミクスデータとクライオFIB粉砕寄生虫のクライオETを組み合わせたさらなる研究により、個々のタンパク質を頂端の複合体構造に配置することが可能になり、それによってその運動と機能の分子的および構造的基盤に新たな光が当たると我々は期待している。

補足図1の系統樹は、RPS11と連結されたHSP90のタンパク質配列のアライメントを使用した1000ブートストラップによるガンマレートの不均一性と経験的頻度を備えたLG置換モデルを使用してRAxMLv8.266で推定されました（アクセッション：AFC36923.1、BESB_021480、 XP_029219085.1、LOC34617734、XP_022591029.1、ETH2_0701200、ETH2_0910900、NCLIV_040880、XP_003884203.1、TGME49_288380、XP_002366350.1、SN3_030 00005、SN3_01300510、PBANKA_0805700、XP_034421046.1、PF3D7_0708400、XP_001351246.1、PVP01_0108700、PVP01_0822500、GNI_014030、XP_011128490。 1、KVP17_001483、KAH0483594.1、FG379_001268、KAH7649672.1、Chro.30427、OLQ16118.1、cgd3_3770、CPATCC_001922、Vbra_12473、CEM00719.1、Cvel_2184 、Cvel_482、AAA30132.1、XP_764864.1、XP_952473.1、XP_952423。 1、XP_001611554.1、XP_001609980.1、XP_002775585.1、XP_002766754.1、XP_001447795.1、XP_001445466.1、XP_001009780.1、XP_001030186.1、AAR27544 .1、XP_009040431.1、XP_009033899.1）。

ヒト包皮線維芽細胞 (HFF; John Boothroyd からの寄贈) を、10% ウシ胎児血清および 2 mM グルタミンを補充したダルベッコ改変イーグル培地で増殖させました。 トキソプラズマ ゴンディ (RH 株) およびネオスポラ カニナム (NC1 株) タキゾイトは、HFF のコンフルエントな単層で維持されました。 界面活性剤で抽出されたトキソプラズマ細胞および関連するサブトモグラムの平均を図7gおよび補足図に示します。 2a ～ f、i ～ k、4a、b、6i。 凍結ＦＩＢ粉砕したＮ．カニナム細胞の断層撮影再構成、および対応するサブ断層撮影の平均およびデータ分析を図１および図２に示す。 1 ～ 6、7a ～ f、h ～ k および補足図。 2g、h、3、4c ～ l、5、6a ～ h、7、8。クライオ ET 用の寄生虫の調製では、高度に感染した HFF 単層を 27 ゲージの針に通すことによって機械的に破壊し、寄生虫を放出しました。 「収縮した円錐形」サンプルの場合、寄生虫は「Endo 緩衝液」（44.7 mM K2SO4、10 mM MgSO4、106 mM スクロース、5 mM グルコース、20 mM Tris-H2SO4、3.5 mg/mL BSA、H2SO4 で pH 8.2）に保存されました。 、寄生虫を細胞内に似た状態で保存します37。 「突出円錐形」サンプルの場合、寄生虫は細胞から放出された後、HEPES pH 7.4 緩衝生理食塩水中に保管されました。 すべての寄生虫を5μmフィルターに通して細胞残骸を除去し、適切な緩衝液で洗浄し、300×gで10分間の遠心分離によって収集した。 寄生虫をそれぞれの緩衝液に再懸濁し、ビヒクル（収縮）または10μMカルシウムイオノフォア（突出; A23187; Cayman Chemicals）とともに37℃で10分間インキュベートしました。 約４μｌの細胞外寄生虫を、グロー放電（−３０ｍＡで３０秒）銅Ｒ２／２穴あきカーボングリッド（Ｑｕａｎｔｉｆｏｉｌ Ｍｉｃｒｏ Ｔｏｏｌｓ ＧｍｂＨ、イエナ、ドイツ）上にピペットで移した。 サンプルをワットマン濾紙（グレード 1）で 3 ～ 4 秒間バックブロットして過剰な液体を除去し、次に自家製プランジフリーザーを使用してグリッドを液体エタンに急速に浸漬して凍結させました。 界面活性剤で抽出したサンプルの場合、HBSS 中で Triton-X-100 を 3 ～ 4 分間添加して膜を抽出した後、上記のように HBSS で簡単に洗浄し、バックブロッティングを行いました。 ガラス化グリッドをクライオ FIB ミリング用のノッチ付きオートグリッド (Thermo Fisher Scientific、マサチューセッツ州、米国) に取り付け、使用するまで液体窒素中で保管しました。

ガラス化した N. caninum 細胞を含むオートグリッドをクライオシャトルにロードし、マイナス 185 °C に予冷されたクライオステージを備えた Aquilos デュアルビーム装置 (FIB/SEM; Thermo Fisher Scientific) に移しました。 グリッドのタイルセット画像を SEM モードで生成し、Maps ソフトウェア (Thermo Fisher Scientific) を使用してクライオ FIB ミリングに適した細胞をターゲットにしました。 試料を保護し、導電性を高めるために、試料表面をマイナス30 mAの電流で20秒間プラチナでスパッタコーティングし、次に27℃に予熱したガス注入システムを使用して有機金属プラチナの層で5秒間コーティングしました。バルクミリングは、ターゲットセルの両側のグリッドに垂直な 50 pA の 30 kV ガリウムイオンビームを使用して実行されました。 次に、ラメラミリングのために、EMグリッドとガリウムイオンビームの間でステージを10°〜18°に傾けました。 粗加工では、30 pA 電流の 30 kV ガリウム イオン ビームでセルを加工し、その後、最終的なラメラの厚さが 150 ～ 200 nm になるまで 10 pA で研磨しました。 粉砕プロセスは、3 keV および 25 pA での SEM イメージングによって監視されました。 合計 178 枚の N. caninum のラメラが複数のセッションにわたって粉砕されました。

ゼロロスで使用される Bioquantum ポストカラムエネルギーフィルター (Gatan、プレザントン、カリフォルニア州) を備えた 300 keV Titan Krios 透過型電子顕微鏡 (Thermo Fisher Scientific) を使用して、寄生虫のガラス化した頂端領域のクライオ FIB 粉砕ラメラを画像化しました。スリット幅 20 eV、焦点デフォーカス -0.5 μm の Volta Phase Plate モード69。 顕微鏡制御ソフトウェア SerialEM v4.0.8 を利用して、Krios を操作し、線量損失モードで線量対称傾斜スキームを使用して 56° から -56° まで 2° 刻みで一連の傾斜を収集しました 70,71。 画像は、5k × 6k K3 直接電子検出カメラ (Gatan) を使用して、倍率 26,000 倍 (ピクセル サイズ 3.15 Å) で取得されました。 K3 カメラのカウント モードが使用され、各チルト画像に対して 15 フレーム (フレームあたりの露光時間 0.04 秒、線量率約 28 e/ピクセル/秒、フレームは超解像モードで記録され、次にビニングされました) 2) 捕獲されました。 一連の傾斜ごとの総電子線量は 100 e/Å2 に制限されました。 合計 167 個の傾斜シリーズが天然寄生虫の低温 FIB 粉砕ラメラから収集されましたが、それらのわずか約 10% に完全または部分的な頂端複合体が含まれていました。 界面活性剤で処理した (クライオ FIB 粉砕ではない) 寄生虫の頂端領域の 19 の傾斜シリーズが記録されました。

私たちの実験では、頂端複合体の収量が低いことに寄与する要因がいくつかあります。 まず、比較的厚い (>1 μm) 氷の層で無傷の寄生虫をプランジ凍結しました。 クライオFIBミリング装置で氷に包埋された細胞の頂端と基底端を決定することは困難です。 次に、クライオ FIB ミリング ステップ中に、氷の厚さが 1 μm 以上から 150 ～ 200 nm に減少し、体積の 80% 以上が除去されました。 したがって、薄板を幅約３００ｎｍの円錐形の領域に正確に配置できる確率は、薄化ステップ中に誤って頂端複合体をミリングして除去することに比べて比較的低い。 最後に、ミリング装置から TEM への移送ステップ中に、ラメラの約 10 ～ 15% が損傷または表面汚染されました。 将来、蛍光誘導クライオFIBミリングおよびオートローダーシステムを応用して、FIBミリングサンプルをTEMに直接移送することで、これらの問題に対処し、実験のスループットを向上できる可能性があります。

各傾斜シリーズ画像のフレームは、MotionCor2 v1.2.3 を使用して動き補正され、IMOD v4.9.3 ソフトウェア パッケージ 72 から抽出されたスクリプトを使用してマージされ、最終的な傾斜シリアル データ セットが生成されました。 チルトシリーズ画像は、パッチトラッキング（800×800ピクセルサイズ）を使用して基準なしで、またはIMODソフトウェアパッケージを使用して基準として暗い特徴（たとえば、スパッタコートからの顆粒またはミリングプロセスからの埋め込みガリウム）を使用して位置合わせされました。 断層撮影再構成は、サブ断層撮影の平均化前の加重逆投影と、粒子ピッキングなどの生の断層撮影データをより高いコントラストで視覚化するための同時反復再構成技術の両方を使用して計算されました。 記録されたクライオFIB加工された天然寄生虫の167個の傾斜シリーズのうち、125個の傾斜シリーズがさらなる検査のために再構築され、再構成された断層像のうち20個に頂端複合体が含まれていた（13個は突出状態、7個は収縮状態）。 円錐ファイバー、ICMT または PCR リピートを含むサブ断層像は、PEET v1.10.0 プログラムを使用して生の断層像から抽出され、位置合わせされ、ミッシングウェッジ補正で平均化されました 73,74。 突出および後退したネイティブの円錐状断層像からそれぞれ約 1160 個および 721 個の 8 nm コノイド線維リピートが選択され、界面活性剤抽出サンプルの再構成断層像から 386 個の 8 nm ICMT リピートが選択されました。 PCR 平均では、4 つの断層像 (3 つの突出円錐形と 1 つの引っ込んだ円錐形) から 180 個のサブ断層像が選択され、IMOD のspikeInit 関数を使用して開始方向を含む初期動機リストが生成されました。 フーリエ シェル相関は、IMOD の calcFSC 関数を使用して計算され、plotFSC 関数を使用してプロットされました。 ミクロネーム先端については、3 つの断層像 (2 つは突出、1 つは引っ込み) から 25 個のサブ断層像が抽出され、位置合わせされ、平均化されました。 データ収集と処理に関するパラメータは補足表 1 にまとめられています。生の断層撮影スライスを視覚化するために、非線形異方性拡散または IMOD に実装された加重メディアン フィルター (平滑フィルター) のいずれかを使用して断層像のノイズを除去し、鮮明さを向上させました。 等値面レンダリングと手動着色による細胞セグメンテーションは、UCSF Chimera v1.10.2 ソフトウェア パッケージ 75 を使用して生成されました。このソフトウェア パッケージは、NIH P41-GM103311 の支援を受けて、カリフォルニア大学サンフランシスコ校のバイオコンピューティング、可視化、および情報学のリソースによって開発されました。 ムービーは Chimera でレンダリングされ、ffmpeg v5.1.1 で圧縮されました。

ロプトリー、ミクロニーム、および小胞は、その独特の形態に基づいて区別できます。 Rhoptries は独特の棍棒の形状をしており、2 つの別個の構造領域、つまり前部の管状頸部と細胞体の奥深くに位置する後部の球部に分けることができます。 ミクロネームは中型の棒状細胞小器官であり、その内部は他の細胞小器官よりも暗い電子密度を示しました。 ICMT または頂端細胞膜と密接に関連する小胞は小さく (直径 <50 nm)、円形または楕円形で、その内容物は細胞質よりも明るく見えます (つまり、電子散乱特性が低い)。

円錐体の寸法を測定するために、底面を水平に向けて断層像を IMOD スライサー ウィンドウ内で回転させました。 次に、補足図5aに示すように、コノイドの中心を横切る縦断面の最大距離を使用してコノイドの寸法を決定しました。 3 つの突出した円錐形と 3 つの引っ込んだ円錐形を測定し、比較しました。 コノイド​​ ファイバーの長さは次のように測定されました。IMOD プログラムを使用してコノイド ファイバーを手動で追跡した後、コノイド ファイバーの長さと隣接するコノイド ファイバー間の間隔は、それぞれ IMOD コマンド imodinfo および mtk を使用して決定されました。 合計で、突き出たコノイドから 20 本の全長コノイド ファイバーと、引っ込んだコノイドから 12 本の全長コノイド ファイバーが測定されました。 突出または後退した円錐形を持つ寄生虫の APR と PCR を比較するために、次のように直径を測定しました。PCR と APR の断面図が保存できるまで、断層像を IMOD スライサー ウィンドウで回転しました (補足図 1 を参照)。 5b、c); 次に、ImageJ (Fiji distribution v1.53c) の円ツールを使用してリングの直径を決定しました。 測定は、突き出たコノイドからの 3 つの APR と 3 つの PCR、および引っ込んだコノイドからの 3 つの APR と 2 つの PCR で行われました。 円錐面と IMC の間の距離は次のように測定されました。IMOD スライサー ウィンドウのビューの中心を IMC の先端に配置し、この中心点を中心に断層像を 3D で回転させて、円錐面と IMC の間の最短距離を見つけました。円錐形と IMC の頂端。

各図パネルの代表的な断層像の数を補足表 S2 にまとめました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

ネオスポラの突出状態と収縮状態の円錐形繊維のサブトモグラム平均密度マップ、および両方の状態からのデータを組み合わせた世界平均が、アクセッション コード EMD-28247、EMD-28249 で電子顕微鏡データ バンク (EMDB) に寄託されています。とEMD-26873をそれぞれ。 PCR P1 ～ P2、P3 のサブトモグラム平均密度マップ、および P1 ～ P2 ～ P3 の複合マップは、アクセッション コード EMD-28231、EMD-28234、および EMD- で電子顕微鏡データ バンク (EMDB) に寄託されています。それぞれ28246。 論文の結論を評価するために必要なその他すべてのデータは、論文および/または補足資料に記載されています。 ソースデータはこのペーパーに付属しています。

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CPRIT Core Facility Support Award RP170644 によって部分的に支援されている、テキサス大学サウスウェスタン医療センターのクライオ電子顕微鏡施設のトレーニングと管理についてダニエル・ストッダード氏に感謝します。 この研究は、ユタ州サウスウェスタン医療センターのリダヒル生物情報科学部にある BioHPC スーパーコンピューティング施設によって提供される計算リソースによって部分的にサポートされました。

カイカイ

現在の住所: テキサス大学サウスウェスタン医療センター生物物理学科、米国テキサス州ダラス

テキサス大学サウスウェスタン医療センター細胞生物学部、米国テキサス州ダラス

ロン・グイ、カイ・カイ、エヴァン・リーツ、ダニエラ・ニカストロ

テキサス大学サウスウェスタン医療センター薬学部、米国テキサス州ダラス

ウィリアム・J・オショーネシー & マイケル・L・リース

米国テキサス州ダラス、テキサス大学サウスウェスタン医療センター生化学部

マイケル・L・リース

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MLR と DN がこのプロジェクトを発案しました。 LG は、断層像の再構成、サブ断層像の平均化、データ分析、図、およびムービーの作成を実行しました。 WJO は細胞培養、サンプル調製、データ分析を実施しました。 KC は、冷凍準備、冷凍 ET データ収集、および初期画像処理を実行しました。 ER はクライオ FIB ミリングを実行しました。 MLR は LG と DN の支援を受けてデータ分析を実行し、原稿を執筆しました。 DN はデータ分析を実行し、プロジェクト全体を監督しました。 この研究は、国立衛生研究所 (NIH; R01GM083122 から DN および R01AI150715 から MLR)、テキサスがん予防研究研究所 (CPRIT; RR140082 から DN)、国立科学財団 (MCB1553334 から MLR) の支援を受けました。ウェルチ財団 (MLR への I-2075-20210327)。

マイケル・L・リースまたはダニエラ・ニカストロとの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読への貢献に対して、Naomi Morrissette と他の匿名の査読者に感謝します。 査読レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Gui、L.、O'Shaughnessy、WJ、Cai、K. 他クライオトモグラフィーにより、アピコンプレクサ侵入機構の剛体の運動と組織化が明らかになります。 Nat Commun 14、1775 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41467-023-37327-w

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受領日: 2022 年 9 月 30 日

受理日: 2023 年 3 月 10 日

発行日: 2023 年 3 月 30 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-37327-w

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