新品では重度の炎症

BMC Medicine volume 20、記事番号: 235 (2022) この記事を引用

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メトリクスの詳細

新生児敗血症は、青年期または成人期に長期の認知障害を引き起こす可能性がありますが、根底にある分子メカニズムは完全には理解されていません。 K+-Cl- 共輸送体 2 (KCC2) の発現は、出生後早期発達における GABA 作動性の脱分極から過分極への移行において極めて重要な役割を果たします。この研究では、新生児の重度の炎症誘発性認知障害が、発達初期における KCC2 の発現と関連しているかどうかを判断することを目的としました。

生後 3 日目 (P3) のラットに高用量のリポ多糖類 (LPS、1 mg kg-1) を腹腔内注射することにより、新生児の重度の炎症が確立されました。モリス水迷路課題と恐怖条件付けテストを使用して、長期の認知機能を調査しました。 ELISA、RT-PCR、およびウェスタンブロッティングを使用して、炎症誘発性サイトカインおよびKCC2の発現レベルを調べました。穿孔パッチクランプ記録を使用して、GABA作動性シフトを決定した。

新生児の重度の炎症は、ラットに長期的な認知障害を引き起こした。一方、海馬では、LPS 注射後 P30 までインターロイキン 1 ベータ (IL-1β) レベルの持続的な上昇が見られました。 LPS 注射後の P7 ～ P10 および P14 ～ P16 ラットの CA1 海馬錐体ニューロンでは、KCC2 の発現上昇と過分極 GABA 逆転電位 (EGABA) が観察されました。 IL-1β mRNA発現の特異的ノックダウンにより、P7～P10およびP14～P16におけるKCC2の発現上昇と過分極EGABAが回復した。したがって、IL-1βまたはKCC2発現の特異的ノックダウンは、新生児の重度の炎症によって誘発される認知障害を改善した。

海馬における IL-1β の持続的な上昇は、発達初期における KCC2 の上方制御により認知障害を誘発する可能性があります。

査読レポート

敗血症は、感染症に対する宿主の反応の調節不全によって生じる、生命を脅かす症候群であり、特に新生児において顕著です。新生児敗血症は通常、生後 1 か月以内の血流への細菌の侵入によって引き起こされ [2]、新生児集中治療室における死亡の主な原因となっています [3、4]。世界保健機関は、新生児敗血症により世界中で年間 100 万人が死亡し、そのうち 42% が生後 1 週間以内に死亡していると推定しています [5]。近年、医学の進歩により新生児敗血症の生存率は著しく向上しています。残念なことに、新生児敗血症生存者は長期的な認知障害のリスクが増加しています[6、7、8]。しかし、新生児敗血症が長期的な認知障害を引き起こす分子機構は依然として不明である。

敗血症中、中枢神経系 (CNS) では TNF、IL-6、IL-1β などの炎症誘発性サイトカインの発現レベルが増加します。これは、敗血症後の長期の認知障害において極めて重要な役割を果たすと考えられています。 9、10]。細菌内毒素であるリポ多糖（LPS）の全身注射は、敗血症後の人間の新生児にも観察される認知障害などの複数の合併症を再現するために新生児の炎症を誘発するために一般的に使用されます[11、12、13、 14]。 LPS の注射は、TNF、IL-6、IL-1β などの炎症誘発性サイトカインの増加を誘発する可能性があります [15]。特に、IL-1βは敗血症後の持続的な神経炎症において極めて重要な役割を果たしており、記憶処理と長期増強、さらには新生児敗血症誘発性認知障害にも密接に関与している[10、16、17]。しかし、IL-1βが、特にCNSの発達期における新生児敗血症誘発性の認知障害をどのように媒介するのかは依然として不明である。

γ-アミノ酪酸 (GABA) は、CNS における主要な抑制性神経伝達物質です。興味深いことに、GABA は、インポーターである Na+-K+-2Cl- 共輸送体 1 (NKCC1) によって維持される高い細胞内塩化物濃度に起因して、脊椎動物の中枢神経系のさまざまな部分の発生初期段階における脱分極効果を媒介します [18]。 GABA の脱分極作用は、細胞の増殖と生存、遊走、分化、および初期のネットワーク配線に関わる重要な役割を果たしています [18]。近年、新たな証拠により、生体内でのGABAシグナル伝達の脱分極の役割についての洞察が得られており、これは領域依存性である可能性がある。例えば、GABA作動性伝達の脱分極効果はマウス海馬の興奮性調節を媒介する[19]が、出生後早期の発育中のマウス新皮質では抑制効果を引き起こす[18、19、20]。出生後の発育中、GABA作動性活性化の脱分極効果から過分極効果への移行は、K+-Cl-共輸送体2(KCC2)の上方制御を介する塩素排出の亢進によって誘発された[21、22、23、24]。この発生期の GABA 作動性シフトは、異なるニューロン集団の成熟段階の指標として機能する可能性があり [25]、シナプスの発達とニューロンの可塑性と関連しています [26]。 KCC2 は、神経成熟時の GABA 作動性機能の極性を設定することに加えて、発生アポトーシスや初期ネットワーク活動の調節など、イオン輸送に依存しない深い機能を有しており、いくつかの疾患に関与しています [18、27、28、29]。

以前の研究では、IL-1βがCNSにおけるKCC2の発現を調節できることが示されている[27、30]が、KCC2の発現変化によって誘発される異常なGABA作動性シフトが新生児敗血症誘発性または重度の炎症誘発性の長期炎症に関与しているかどうかは不明である。認識機能障害。本明細書では、IL-1βレベルの持続的な上昇が、発達期のCA1海馬錐体ニューロンにおけるKCC2発現を調節することによってGABA作動性シフトに影響を及ぼし、最終的に新生児の重度の炎症後の長期認知障害に寄与したという仮説を立てた。

実験プロトコルは、四川大学西中国病院（中国四川省成都）の動物倫理委員会によって承認され、動物研究：生体内実験の報告（ARRIVE）ガイドラインに従って実施されました。妊娠 16 日目の Sprague-Dawley ラットを購入し (Chengdu Dossy Experimental Animals CO., LTD.)、分離し、子の誕生日を監視しました。出生後の子（雌雄とも）は母親と一緒に飼育され、食物と水は自由に摂取できるようにした。動物は、一定の湿度（45%～55%）と温度（22～24℃）で12時間（7:00～19:00）の明暗サイクル下で維持されました。 P21で離乳した後、動物をケージ当たり5匹のラットのグループに分けて飼育した。

LPS (Sigma、米国) を生理食塩水に溶解し、P3 で 1 mg kg-1 の用量で腹腔内注射しました。 IL-1β-siRNA (センス配列: 5'-GCACAGACCUGUCUUCCUATT-3'、アンチセンス配列: 5'-UAGGAAGACAGGUCUGUGCTT-3')、5'-FAM を修飾した KCC2-siRNA (センス配列: 5'-GCCAUUUCCAUGAGCGCAATT-) 3'; アンチセンス配列: 5'-UUGCGCUCAUGGAAAAUGGCTT-3') と 5'-CY5 の修飾、およびネガティブコントロール (Control-siRNA、センス配列: 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'; アンチセンス配列: 5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-) ３'）（ＧｅｎｅＰｈａｒｍａ、上海、中国）をＲＮａｓｅを含まない水に溶解した。注射の20分前に、IL-1β-siRNA、KCC2-siRNA、またはネガティブコントロールをIn vivo SilenceMag™トランスフェクション試薬（OZ Biosciences、マルセイユ、フランス）と最終濃度1μg μL-1まで混合しました。次に、IL-1β-siRNA、KCC2-siRNA、またはネガティブコントロールを、P2および/またはP7で海馬の両側CA1領域に注射した(各側0.5μL)。

以前の研究 [31] に記載されているように、ラットを氷上に置き、低体温麻酔を導入し、定位固定装置 (RWD、深セン、中国) に取り付けました。眼科用軟膏をＰ７ラットの目に塗布した。 IL-1β-siRNA/KCC2-siRNA/control-siRNA (0.5 μL) を海馬 CA1 領域 (ブレグマと矢状縫合線の間の中間点、横方向: ± 1.5 mm、深さ: P2 および 1.6 の場合 1.2 ～ 1.4 mm) に両側注射しました。 P7 の場合 –1.8 mm）、100 nL min−1 の速度で。注入完了後、ガラスピペットを所定の位置に 5 分間放置し、逆流を避けるためにゆっくりと引き抜きました。その後、動物を暖房ブランケットで回復させてから、ホームケージに戻しました。

同腹子への影響を最小限に抑えるために、各同腹子からの両性の出生後の子孫を実験グループにランダムに割り当てました。その後、子犬を母犬に戻し、P21まで離乳させた。 P21以降、ラットを各実験グループに集め、ケージ当たり5匹のラット(同性)をランダムに収容した。したがって、各ケージ内のラットは、異なってランダムな同腹子からのものであった。すべての動物の割り当ては、各同腹子からの性別と治療がほぼ均等に分配されるように行われました。実験のさまざまなコホートには、異なる同腹子のセットは使用されませんでした。新生児重度炎症モデルは、P3 ラットに高用量の LPS (1 mg kg-1) を腹腔内注射することによって誘発されました。対照群では、ラットに生理食塩水 (NS) のみを腹腔内注射しました。 LPS 群では、ラットに LPS のみを腹腔内注射しました。 NS + 対照 siRNA グループでは、ラットに対照 siRNA の海馬 CA1 注射と生理食塩水の腹腔内注射を与えました。 LPS + コントロール siRNA グループでは、ラットはコントロール siRNA の海馬 CA1 注射と LPS の腹腔内注射を受けました。 LPS + IL-1β-siRNA 群では、ラットは IL-1β-siRNA の海馬 CA1 注射と LPS の腹腔内注射を受けました。 LPS + KCC2-siRNA 群では、ラットは KCC2-siRNA の海馬 CA1 注射と LPS の腹腔内注射を受けました。

青年ラットの空間学習と記憶は、以前に記載されているようにモリス水迷路テストによって評価されました [32]。簡単に説明すると、このシステムは、4 つの象限に分割された円形プール (直径 90 cm、深さ 50 cm) で構成されていました。空間的な視覚的手がかりとして、さまざまな形の物体が各象限の壁に取り付けられました。水の温度は 30 ± 1 °C に維持しました。直径 10 cm の円形のプラットフォームを、黒い水の表面から 1 cm 下、プールの壁から 30 cm 離れた場所に置きました。プラットフォームを含む象限がターゲット象限として定義されました。ラットの遊泳軌跡は自動ビデオカメラで記録された。方向ナビゲーション試験の前に、すべてのラットは 4 日間連続して 1 日 3 回訓練されました。ラットをプールの壁に顔を向けて水中に入れた。ラットが 90 秒以内にプラットフォームを発見し、15 秒間プラットフォームに留まった場合、その期間を逃避潜時として定義しました。それ以外の場合は、ラットをプラットフォームに誘導して 15 秒間滞在させ、脱出潜時を 90 秒と記録しました。試験中、プラットフォームは取り外され、ラットは 90 秒間泳ぐことができました。目標エリア内の横断回数、所要時間、目標象限内を移動した合計距離、および平均速度が記録されました。 SMART ソフトウェア (Panlab、スペイン、バルセロナ) を使用して、各ラットの遊泳軌跡を分析しました。

モリス水迷路の 2 日後、同じラットに、以前に記載したパラダイムに若干の変更を加えた恐怖条件付けテストを実施しました [33]。ラットは、文脈（部屋）を嫌悪刺激（フットショック、無条件刺激、米国）と結びつけるように訓練されており、これを使用して、海馬に依存する文脈上の恐怖条件付けを評価することができる。足へのショックはまた、海馬に依存しない手がかりによる恐怖条件付けを評価するために、音の手がかり（条件刺激、CS）と組み合わせられました。条件付けされた恐怖は、ラットがその文脈または音調に再度さらされたときに、呼吸を除くすべての動きを停止することにより、すくむような行動として示されました。トレーニングパラメーターは次のとおりです。トーン、30 秒、80 dB、2 kHz。衝撃、2 秒、0.8 mA。 1日目に、各ラットを恐怖条件付けチャンバーに入れ、2分間自由に探索させました。次に、トーンが発せられ、続いてフットショックが発せられた。 2 分後、2 台目の CS-US ペアが配信されました。 2日目に、各ラットを同じ恐怖条件付けチャンバーに再曝露しましたが、CSまたは足へのショックは与えませんでした。凍結は 3 分間記録されました。 1 時間後、各ラットを、異なる匂い、洗浄液、床の質感、部屋の壁を含む新しい環境に置きました。ラットに 2 分間探索させてから、音を再度曝露しました。凍結を 3 分間評価し、次に ANY 迷路ビデオ追跡システムおよびソフトウェア (Stoelting、Wood Dale、IL) を使用して測定しました。

ラットをペントバルビタールナトリウム（100 mg kg-1）で麻酔し、氷冷リンゲル液で経心臓的に灌流した。海馬を素早く取り出し、ホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤を含む氷冷溶解緩衝液（Beyotime、中国）でホモジナイズした。タンパク質濃度はBCAタンパク質アッセイキット(Beyotime、中国)により測定した。 20 マイクログラムのタンパク質サンプルを NuPAGETM4-12% Bis-Tris Gel (Thermo Fisher Scientific) で分離し、iBLOT2 システムを使用してポリ二フッ化ビニリデン膜 (Thermo Fisher Scientific) に転写しました。メンブレンを、0.1% Tween-20 および 5% 無脂肪乳を含む Tris 緩衝生理食塩水中で 2 時間ブロックし、ウサギ抗 IL-1β (1:2000、Abcam) を含む一次抗体とともに 4 °C で一晩インキュベートしました。）、ウサギ抗ＫＣＣ２（１：１０００、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、およびウサギ抗β－アクチン（１：１０００、Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ）。次に、メンブレンを西洋わさびペルオキシダーゼ結合抗ウサギ（1:5000、Proteintech、中国）とともに室温で 1 時間インキュベートし、Chemidoc XRS システムを使用して化学発光試薬（ECL; Amersham Pharmacia Biotech、ニュージャージー州ピスカタウェイ）でスキャンしました。（バイオラッド）。バンドの密度をImageJソフトウェアによって分析した。対照群のバンドの密度を 100% に設定しました。他のグループからの相対密度値は、それぞれをβ-アクチンに対して正規化した後、これらのグループからの密度値を対照値で割ることによって決定されました。ウェスタンブロット結果の元の画像は追加ファイル 1 に示されています。

Eastep® Super RNA 抽出キット (Promega、上海、中国) を使用して海馬の全 RNA を単離し、続いてメーカーのプロトコールに従って GoScript™ 逆転写キット (Promega、上海、中国) で逆転写しました。最後に、GoTaq® qPCR Master Mix (Promega、上海、中国) および特定のプライマー (Sangon Biotech、上海、中国) を使用して RT-PCR を実行しました。遺伝子発現の相対的な倍率変化は、GAPDH を内部対照として 2-ΔΔCt 法で計算されました [34]。 TNF、IL-6、IL-1β、KCC2、および GAPDH mRNA の検出に使用したプライマーは次のとおりです。

TNF フォワード: 5'-CTGTGAAGGGAATGGGTGTT-3';

TNF リバース: 5'-CAGGGAAGAATCTGGAAAGGTC-3';

IL-6 フォワード: 5'-GGGCCTTGCTTTCTCTTCG-3';

IL-6 逆方向: 5'-ATAATAAAGTTTTGATTATGT-3';

IL-1β フォワード: 5'-AGTTGACGGACCCAAAAG-3';

IL-1β 逆方向: 5'-AGCTGGATGCTCTCATCAGG-3';

KCC2 フォワード: 5'- AGGTGGAAGTCGTGGAGATG-3';

KCC2 逆方向: 5'-CGAGTGTTGGCTGGATTCTT-3';

GAPDH フォワード: 5'-GACATGCCGCCTGGAGAAAC-3';

GAPDH 逆方向: 5'-AGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3'。

ELISA 実験は、血清中の TNF、IL-1β、IL-6 などの炎症誘発性サイトカインのレベルを定量化するために実行されました。簡単に言うと、ラットを約 3% のセボフルランで麻酔しました。血液サンプル (200 ～ 500 μL) を心臓から直接採取し、EDTA チューブに保存し、室温で少なくとも 30 分間インキュベートしました。次に、サンプルを室温で 2000 g で 20 分間遠心分離して、細胞血液成分から血清を分離しました。上清を直ちに抽出し、液体窒素中で凍結させた。 ELISAキット(Neobioscience)を製造業者の指示に従ってサイトカインレベルを測定するために使用した。 450nmでの吸光度は、Magellanソフトウェアに接続された680nmでの波長補正を備えたTecan SunriseTMマイクロプレートリーダーを用いて測定した。サンプルのタンパク質濃度は、既知の標準サンプルの光学密度に従って測定された反応の光学密度によって決定されました。

両性のＰ７〜Ｐ１０、Ｐ１４〜Ｐ１６、またはＰ２８〜Ｐ３２のラットをペントバルビタールナトリウム（１００ｍｇｋｇ−１）で麻酔した。脳を迅速に解剖し、（mMで）260ショ糖、26NaHCO3、3KCl、1.25NaH2PO4、1CaCl2、ビブラトーム (VT1000 A; Leica) を使用して、5 MgCl2、および 10 グルコース。スライスをすぐに移し、130 NaCl、3 KCl、2 MgCl2、2 CaCl2、1.25 NaH2PO4、26 NaHCO3、および 10 グルコース (mM) を含む人工脳脊髄液とともに 35 °C で 45 分間インキュベートし、その後室温で維持しました。記録前に 30 分間、温度 (24 ～ 26 °C) に保ちます。スライスおよびインキュベーション溶液を、pH 7.35 で 95% O2/5% CO2 で連続的にバブリングしました。

海馬スライスを記録チャンバーに取り付け、人工脳脊髄液（aCSF）を流速2〜3 ml min-1で灌流し、95％O2および5％CO2、pH = 7.35でバブリングしました。 CA1錐体細胞は、CA2/CA1境界付近から開始し、十分に離れた位置で内側に向かって順にプローブされました。次に、錐体ニューロンは、細胞体層内の位置および錐体形状によって、差分コントラスト/赤外照明下で同定されました。穴あき記録は、140 K-グルコン酸塩、10 HEPES、5 EGTA、1 MgCl2、2 Na2-ATP、0.3 Na2-GTP、pH 7.2 に調整された内部溶液を満たしたパッチピペット (6 ～ 8 MΩ) を使用して行われました。 KOH を使用し、浸透圧は約 285 mOsm です。パッチピペットには、標準内部溶液を最小限に前充填し、その後、グラミシジン含有溶液を再充填した。最終濃度 50 μg mL-1 でジメチルスルホキシド (DMSO) に溶解したグラミシジン (HY-P0163、MedChemExpress) を、穿孔記録用の細孔形成剤として使用しました。グラミシジンチャネルは、一価の陽イオンおよび小さな中性分子に対して選択的に透過性ですが、塩化物に対しては不透過性であるため、アニオン勾配を乱すことなく、記録されたニューロンへの電気的アクセスが可能になります。ギガシール形成後約 20 ～ 40 分以内に、アクセス抵抗はゆっくりと低下し、約 20 ～ 35 MΩ で安定しました。次に、静止膜電位 (RMP) を、電流が注入されていないときの電圧として記録しました。塩化物濃度を推定するために、GABA 逆転電位 (EGABA) を評価しました。ニューロンは –60 mV に保持され、膜電位は –80 ～ –30 mV のさまざまな試験電位に段階的に変化しました。各膜電位ステップ中に、細胞外溶液中の GABA (10 μM) がバス適用によって送達され、シアンキキサリン (CNQX、10 μM) および DL-2-アミノ-5-ホスホペンタン酸 (40 μM) の存在下で電流を活性化しました。 GABA誘導電流の振幅対膜電位間の線形回帰を計算し、この線と横軸の切片をEGABAとした。すべての電気生理学的記録は、pClamp 10.2 ソフトウェア (Molecular Devices、米国サニーベール) を実行するコンピューターにリンクされた Axopatch 700B 増幅器および Digidata1440 デジタイザーを使用して実行されました。信号は 20 kHz でサンプリングされ、10 kHz でフィルタリングされました。セルと電極の静電容量は、記録中に電子的に補正されました。アクセス抵抗が 25% を超えて変化した場合、セルは廃棄されました。

データは平均値 ± 標準偏差 (SD) として表され、統計分析は GraphPad Prism 8.0 ソフトウェア (GraphPad Software, CA, USA) を使用して実行されました。データ分布の正規性は、Shapiro-Wilk 検定を使用して評価されました。 2 つのグループ間のパラメトリック分布データまたはノンパラメトリック分布データの比較には、対応のある/対応のないスチューデントの t 検定またはマン-ホイットニー U 検定がそれぞれ使用されました。 3 つ以上のグループからのデータは、一元配置または二元配置分散分析 (ANOVA) を使用して分析され、反復測定とそれに続くボンフェローニまたはテューキー事後検定が行われました。各比較に使用された正確な分析は図の凡例に記載されており、各結果のすべての統計情報は追加ファイル 2: 表 S1 ～ S11 にまとめられています。 P < 0.05 は統計的に有意であるとみなされました。

新生児炎症モデルを P3 ラットに誘導しました (図 1A)。対照群と比較して、LPS 群では発育中のラットの体重増加が遅かった（図 1B、n=8、** P < 0.01、*** P < 0.001 対対照群）。対照群のラットでは死亡は見られなかったが、LPS 群では 36.7% の死亡率が観察された (図 1C、** P < 0.01)。モリス水迷路 (MWM) タスクのトレーニングは P28 から P31 まで実施されました。 4日間の獲得訓練中に、対照群とLPS群の両方のラットで逃避潜時が徐々に減少し、両群が海馬に依存した空間学習と記憶形成を示したことが示唆されました（図1D）。ただし、LPS グループのラットの逃避潜時は、訓練 4 日目の対照ラットと比較して有意に増加しており、記憶形成に潜在的な障害があることが示されました (図 1D、n= 15 ～ 19、P = 0.029)。空間プローブテスト中 (図 1E)、費やした時間 (図 1F、n= 15–19、*** P < 0.001) および距離 (図 1G、n= 15–19、*** P) < 0.001）、およびプラットフォームを横切る時間（図 1H、n = 15 ～ 19、*** P < 0.001）は、対照グループと比較して LPS グループで減少しました。 2つのグループ間のラットの平均速度には有意差は見られず（図1I、n = 15〜19、P = 0.065）、運動能力がLPS注射の影響を受けなかったことを示唆しています。次に、同じラットに恐怖条件付け (FC) テストを実施しました (図 1J)。 P34での訓練後（図1K）、LPSグループのラットは、対照グループと比較して、海馬依存性状況テストにおいてすくみの減少を示しました（図1L、n = 15〜19、*** P < 0.001）。しかし、P35での海馬非依存性キュートーンテストでは差は観察されませんでした（図1M、n = 15〜19、P = 0.474）。

新生児の重度の炎症は、思春期のラットに長期にわたる認知障害を引き起こします。 (A) 炎症モデルと認知テストの確立に使用される時系列順を示す概略図。この実験コホートでは 5 頭の同腹子が使用されました。 (B) ラットの体重の変化 (n = 8)。 (C) ラットの生存曲線。 (D) 脱出待ち時間の学習曲線。 (E) MWM テストの代表的なトレース。 (F) ターゲット象限で費やした時間 (n = 15 ～ 19)。 (G) ターゲット象限内で費やした距離 (n = 15 ～ 19)。 (H) ホーム踏切の数 (n = 15 ～ 19)。 (I) 空間プローブテスト中の平均速度 (n = 15 ～ 19)。 (J) FC の実験プロトコル。 (K) FC トレーニング中のラットの凍結時間。 (L) コンテキスト FC テストにおけるラットのすくみ時間 (n = 15 ～ 19)。 (M) キュード FC テストにおけるラットのすくみ時間 (n = 15 ～ 19)。 LPS：リポ多糖類。 NS:生理食塩水。 MWM: モリス水迷路。 FC: 恐怖条件付け。パネル B、D、および K は、反復測定とその後のボンフェローニ事後検定を伴う二元配置分散分析によって比較されました。パネル C はログランク検定によって比較されました。パネル F、G、H、I、L、および M は、対応のない両側スチューデント t 検定によって比較されました。 * P < 0.05、** P < 0.01、および *** P < 0.001、ns: 有意性なし。エラーバーはSDを示します

注目すべきことに、新生児の重度の炎症誘発性認知障害が性別に依存するかどうかを判断するために、ピアレビュー中に追加の分析が実行されました。雄と雌の敗血症ラットの両方が同様の滞在時間の減少を示したため、MWM テストでは有意な性差は見つかりませんでした (追加ファイル 3: 図 S1A 左、n = 9、** P < 0.01、雄; 追加ファイル 3: 図S1A 右、n = 6–10、** P < 0.01 (女性)) と距離 (追加ファイル 3: 図 S1B 左、n = 9、** P < 0.01 (男性)、追加ファイル 3: 図 S1B右、n = 6–10、女性の場合は P = 0.046）、ターゲット象限内での時間、およびプラットフォームを横切る時間（追加ファイル 3: 図 S1C 左、n = 9、*** 男性の場合 P < 0.001。追加ファイル 3: 図 S1C 右、n = 6 ～ 10、*** P < 0.001 (メス)) 対照ラットと比較した場合。同様に、対照群と比較して、文脈テストにおけるすくみの減少 (追加ファイル 3: 図 S1D 左、n = 9、*** P < 0.001、男性; 追加ファイル 3: 図 S1D 右、n = 6-10 、*** 女性の場合は P < 0.001）、キュートーンテストでは差なし（追加ファイル 3: 図 S1E 左、n = 9、男性の P = 0.301; 追加ファイル 3: 図 S1E 右、n = 6 -10、メスの場合 P = 0.949）は、LPS を投与されたラットの雌雄両方で観察されました。これらの結果は、新生児の重度の炎症が男女問わず長期の認知障害を引き起こす可能性があることを示唆しています。

末梢血中の炎症誘発性サイトカインのレベルを、LPS注射後のさまざまな時点でELISAによって検査しました（図2A）。結果は、TNF (図 2B、n= 6、** P < 0.01)、IL-6 (図 2D、n= 6、** P < 0.01、*** P < 0.001)、および IL-1β であることを示しました。 (図 2F、n = 6、** P < 0.01、*** P < 0.001) LPS 注射後 2 時間、4 時間、および 6 時間で有意に増加しましたが、いずれも対照レベルに戻りました。 LPS 注射の 24 時間後 (図 2B、2D、2F、n=6、P > 0.05)。次に、海馬におけるこれらの炎症誘発性サイトカインの発現レベルをRT-PCRおよびウェスタンブロッティングにより調べました。対照ラットと比較して、TNF (図 2C、n= 6、** P < 0.01) および IL-6 (図 2E、n= 6、** P < 0.01) の mRNA 発現レベルは、ラットで顕著に上昇しました。 LPS 注射後 6 時間で海馬は減少しましたが、P5 では両方とも対照レベルに戻りました (図 2C、2E、n= 6、P > 0.05)。注目すべきは、IL-1β mRNA (図 2G、n = 6、** P < 0.01) およびタンパク質 (追加ファイル 3: 図 S2、n = 6、** P < 0.01、*** P) のレベルの上昇です。 < 0.001) は少なくとも P30 まで維持され、重度の新生児炎症後の CNS における主な炎症誘発性サイトカインは IL-1β であることが示唆されました。

新生児の重度の炎症は、ラットの海馬における IL-1β の持続的な上昇を引き起こします。 (A) 新生児炎症後の炎症誘発性サイトカイン検査に使用される時系列順を示す概略図。この実験コホートでは 14 頭の同腹子が使用されました。 (B、D、F) 2 時間 (n = 6)、4 時間 (n = 6) における末梢血血清中の TNF (B)、IL-6 (D)、および IL-1β (F) のタンパク質レベルを示す ELISA 結果。 = 6)、6 時間 (n = 6)、および 24 時間 (n = 6)。 (C、E、G) LPS 注射後 6 時間後の海馬 TNF (C) および IL-6 (E) の mRNA レベルを示す PCR 結果 (n = 6)、P5 (n = 6)、P7 (n = 6) )、P14 (n = 6)、および LPS 注射後の IL-1β (G) 6 時間 (n = 6)、P5 (n = 6)、P7 (n = 6)、P14 (n = 6)、およびP30 (n = 6)。 LPS: リポ多糖、NS: 生理食塩水、パネル B、C、D、E、F、G は対応のない両側スチューデント t 検定またはマンホイットニー U 検定によって比較されました。 ** P < 0.01 および *** P < 0.001、ns: 有意性なし。エラーバーはSDを示します

新生児の炎症誘発性認知障害におけるIL-1βレベルの持続的な増加の役割を調べるために、IL-1β-siRNAを海馬のCA1領域に両側から注射して、IL-1β mRNAの発現をノックダウンしました（図3A）。。 IL-1β-siRNAによって運ばれる蛍光がCA1で検出されました（追加ファイル3：図S3A）。 IL-1β mRNA レベルは、注射の 2 日後に IL-1β-siRNA によって有意に減少しました (図 3B、n= 6、*** P < 0.001)。 LPS + コントロール siRNA グループと比較して、NS + コントロール siRNA (図 3C、*** P < 0.001) および LPS + IL-1β-siRNA (図 3C、** P) からのラットの逃避潜時< 0.01) グループは、MWM トレーニング 4 日目に有意に減少しました。 MWM 検査の場合、IL-1β-siRNA による治療は新生児の炎症誘発性認知障害を有意に改善しました (図 3D-3F、n= 15-24、*P = 0.012、** P < 0.01、*** P < 0.001)。。 3つのグループすべての間でラットの平均速度に有意差は見つかりませんでした（図3G、n = 15〜24、P = 0.611）。 FC の場合、訓練後 (図 3H)、LPS + IL-1β-siRNA グループのラットは、LPS + 対照 siRNA グループと比較して、海馬依存性状況テストにおいてすくみの増加を示しました (図 3I、n= 15) -24、** P < 0.01、*** P < 0.001)。これら 3 つのグループ間で、海馬に依存しないキュートーンテストでは差は観察されませんでした（図 3J、n = 15〜24、P = 0.786）。これらの所見は、IL-1β レベルの上昇が持続すると、新生児炎症後の長期の認知障害に寄与することを示しています。

海馬の IL-1β レベルの持続的な上昇は、新生児の重度の炎症後の長期的な認知障害の一因となります。 (A) siRNA 送達、LPS 投与、および認知テストに使用される時系列順序を示す概略図。この実験コホートでは 8 頭の同腹子が使用されました。 (B) IL-1β-siRNA のノックダウン効率を示す PCR の結果 (n = 6)。 (C) 脱出待ち時間の学習曲線。 (D) ターゲット象限で費やした時間 (n = 15 ～ 24)。 (E) ターゲット象限内で費やした距離 (n = 15 ～ 24)。 (F) ホーム踏切の数 (n = 15 ～ 24)。 (G) 空間プローブテスト中の平均速度 (n = 15 ～ 24)。 (H) FC トレーニングにおけるラットの凍結時間。 (I) コンテキスト FC テストにおけるラットのすくみ時間 (n = 15 ～ 24)。 (J) キュード FC テストにおけるラットのすくみ時間 (n = 15 ～ 24)。 LPS：リポ多糖類。 NS:生理食塩水。 MWM: モリス水迷路。 FC: 恐怖条件付け。パネル B は、対応のない両側スチューデント t 検定によって比較されました。パネル C と H は、反復測定とそれに続くボンフェローニ事後検定を伴う二元配置分散分析によって比較されました。パネル D、E、F、G、I、および J は、反復測定とその後の Tukey 事後検定を伴う一元配置分散分析によって比較されました。 ** P < 0.01 および *** P < 0.001、ns: 有意性なし。エラーバーはSDを示します

まず、ラットの発生中に KCC2 発現が性特異的であるかどうかを調べました。 KCC2 発現レベルは、P3 から P14 まで海馬で徐々に増加しました。 KCC2の発現レベル（追加ファイル3：図S4A、n = 6、P > 0.05;追加ファイル3：図S4B、n = 4、P > 0.05）は、P3からP14まで性差を示さなかった。次に、P3 での LPS 注射が P7 (図 4B 左パネル、n = 6、*** P < 0.001) および P14 (図 4B 中央パネル、n = 6、**) で KCC2 発現の増加を誘導することを発見しました。 * P < 0.001) 正常対照と比較。Ｐ３０におけるラットにおけるＫＣＣ２発現には、ＬＰＳ群と対照群との間で差異は見られなかった（図４Ｂ右パネル、ｎ＝６、Ｐ＞０．０５）。これらの結果は、新生児の炎症が発生初期における KCC2 の発現レベルの増加を促進する可能性があることを示しています。

KCC2 は、新生児の重度の炎症誘発性認知障害に対する IL-1β の効果を仲介します。 (A) 炎症モデルの確立と KCC2 レベルのテストに使用される時系列順を示す概略図。この実験コホートでは 5 頭の同腹子が使用されました。 (B) LPS 注射後の P7 (左パネル、n = 6)、P14 (中央パネル、n = 6)、および P30 (右パネル、n = 6) ラットにおける KCC2 のタンパク質レベル。 (C) siRNA 注射、炎症モデルの確立、および認知テストに使用される時系列順序を示す概略図。この実験コホートでは 9 頭の同腹子が使用されました。 (D) PCR による KCC2-siRNA のノックダウン効率 (n = 6)。 (E) 脱出待ち時間の学習曲線。 (F) ターゲット象限で費やした時間 (n = 10 ～ 15)。 (G) ターゲット象限内で費やした距離 (n = 10 ～ 15)。 (H) ホーム踏切の数 (n = 10 ～ 15)。 (I) 空間プローブテスト中の平均速度 (n = 10 ～ 15)。 (J) FC トレーニング中のラットの凍結時間。 (K) コンテキスト FC テストにおけるラットのすくみ時間 (n = 10-15)。 (L) キュード FC テストにおけるラットのすくみ時間 (n = 10-15)。 LPS：リポ多糖類。 NS:生理食塩水。 MWM: モリス水迷路。 FC: 恐怖条件付け。パネル B と D は、対応のない両側スチューデント t 検定によって比較されました。パネル F、G、H、I、K、L は、反復測定とその後の Tukey 事後検定を伴う一元配置分散分析によって比較されました。 * P < 0.05、** P < 0.01、および *** P < 0.001、ns: 有意性なし。エラーバーはSDを示します

KCC2-siRNA は、海馬の CA1 における KCC2 の発現を低下させるために使用されました。 KCC2-siRNAによって運ばれる蛍光がCA1で検出されました（追加ファイル3：図S3B）。 KCC2-siRNAのノックダウン効率はRT-PCRによって確認された(図4D、n=6、*** P<0.001)。 IL-1β-siRNA注射は、P7で海馬におけるIL-1βの発現を減少させた（追加ファイル3：図S5A左パネル、n = 6-8、*** P < 0.001;追加ファイル3：図S6左）パネル、n = 6、*** P < 0.001)、P14 (追加ファイル 3: 図 S5A 中央パネル、n = 6、** P < 0.01; 追加ファイル 3: 図 S6 中央パネル、n = 6、 ** P < 0.01) および LPS 注射後の P30 (追加ファイル 3: 図 S5A 右パネル、n = 6、* P = 0.037; 追加ファイル 3: 図 S6 右パネル、n = 6、* P = 0.013) P3で。 KCC2-siRNA注射は、P7で海馬におけるKCC2の発現を減少させた（追加ファイル3：図S5B左パネル、n = 6、* P = 0.025;追加ファイル3：図S7左パネル、n = 6、* P = 0.024) および P14 (追加ファイル 3: 図 S5B 中央パネル、n = 6、** P < 0.01; 追加ファイル 3: 図 S7 中央パネル、n = 6、* P = 0.014) P3 での LPS 注入後。さらに、IL-1β発現のノックダウンはKCC2発現の増加を阻害した（追加ファイル3：図S5Bの左および中央のパネル、n = 6、* P7の場合はP = 0.044、* P14の場合はP = 0.038、追加ファイル3：図S5B）。 .S7 中央パネル、n = 6、* P14 の P = 0.037）LPS 注射によって誘発。したがって、新生児の重度の炎症によって誘発される認知障害は、IL-1β-siRNAおよび/またはKCC2-siRNAの注射によって大幅に改善されました（図4F〜4H、4K、n = 10〜15、* P < 0.05、** P < 0.01、*** P < 0.001）、GABA作動性発達期間中のIL-1βおよび/またはKCC2発現の上昇を阻害することで、新生児の重度の炎症によって誘発される長期の認知障害を防ぐことができたことを示しています。

次に、P7〜P10、P14〜P16、およびP28〜P32におけるラットのCA1錐体ニューロンの固有の電気生理学的特性に対する新生児炎症の影響に取り組みました（図5A）。 GABA 逆転電位 (EGABA) は、新生児の重度の炎症後の CA1 スライスの塩化物恒常性の変化を直接テストするために決定されました。新生児の炎症は、P7〜P10（図5B〜5D、4〜5匹のラットからのn = 10〜12細胞、*** P < 0.001）およびP14〜P16（図5F〜5H）の両方でEGABAの有意な過分極シフトを引き起こしました。、3〜4匹のラットからのn = 7細胞、** P < 0.01）、過分極静止膜電位（RMP）を伴います（図5E、5〜6匹のラットからのn = 9〜14細胞、** P < 0.01） ; 図 5I、n= 4 ～ 5 匹のラットからの 10 ～ 13 細胞、* P < 0.01)。 IL-1β発現またはKCC2発現のノックダウンは、EGABAにおける新生児の炎症誘発性過分極シフトを緩和した（図5M-5O、n = 3〜4匹のラットからの7〜8細胞、 * P = 0.02 vs. LPS + IL-1β- siRNA グループ、* P = 0.033 対 LPS + KCC2-siRNA グループ; 図 5Q-5R、n= 3 ～ 4 匹のラットからの 5 ～ 7 細胞、* P = 0.02、** P < 0.01）および過分極 RMP（図5P、4 ～ 5 匹のラットからの n= 7 ～ 11 細胞、* P = 0.025 対 LPS + IL-1β-siRNA グループ、* P = 0.023 対 LPS + KCC2-siRNA グループ、図 5S、n= 7 3 ～ 4 匹のラットからの –9 細胞、P7 ～ P10 および P14 ～ P16 の両方で * P = 0.022 vs. LPS + IL-1β-siRNA グループ、* P = 0.011 vs. LPS + KCC2-siRNA グループ）。 EGABA（図5J〜5K、3〜4匹のラットからのn = 6〜7細胞、P > 0.05）またはRMP（図5L、4〜5匹のラットからのn = 8〜10細胞）には有意差は見つかりませんでした。、Ｐ＞０．０５）、ＬＰＳ群と対照群との間のＰ２８〜Ｐ３２ラットにおいて。

EGABAは、新生児の重度の炎症後のラットのCA1錐体ニューロンで過分極します。 (A) siRNA 送達、LPS 投与、および穿孔パッチ記録に使用される時系列順序を示す概略図。この実験コホートでは 15 頭の同腹子が使用されました。 (B) P7 ～ P10 の海馬ニューロンの -80 ～ -30 mV の 10 mV 刻みの保持電位までの GABA 誘導電流の代表的なトレース。（C）P7〜P10の錐体ニューロンの10mV刻みで-80〜-30mVの異なる保持電位で記録されたGABA誘導電流の電流電圧（IV）曲線。（D）P7〜P10における敗血症ラットの過分極シフトを示すすべてのIV曲線から得られた細胞あたりのEGABA値（4〜5匹のラットからのn = 10〜12細胞）。（E）P7〜10の敗血症ラットにおける過分極シフトを示すRMP値（n = 5〜6匹のラットからの9〜14細胞）。 (F) P14 ～ P16 における海馬ニューロンの -80 ～ -30 mV の 10 mV 刻みの保持電位までの GABA 誘導電流の代表的なトレース。（G）P14の錐体ニューロンの10 mV刻みで-80から-30 mVまでの異なる保持電位で記録されたGABA誘導電流の電流電圧（IV）曲線。（H）P14〜P16における敗血症ラットの過分極シフトを示すすべてのIV曲線から得られた細胞あたりのEGABA値（3〜4匹のラットからのn = 7細胞）。（I）P14〜P16での敗血症ラットの過分極シフトを示すRMP値（4〜5匹のラットからのn = 10〜13細胞）。（J）P28〜P32の錐体ニューロンの10mV刻みで-80〜-30mVの異なる保持電位で記録された自発GABA誘導電流の電流電圧（IV）曲線。 (K) P28-32 における敗血症ラットの過分極シフトを示すすべての IV 曲線から得られた細胞あたりの EGABA 値 (3 ～ 4 匹のラットからの n = 6 ～ 7 細胞)。 (L) P28〜P32における敗血症ラットの過分極シフトを示すRMP値(n = 4〜5匹のラットからの8〜10細胞)。 (M) siRNA注射後のP7〜P10における海馬ニューロンの-80〜-30mVの10mV増分における保持電位までのGABA誘導電流の代表的なトレース。 (N) siRNA注射後のP7〜P10における錐体ニューロンの10 mV増分で-80〜-30 mVの異なる保持電位で記録されたGABA誘導電流の電流電圧(IV)曲線。 (O) siRNA 注射後の P7 ～ P10 のすべての IV 曲線から得られた細胞あたりの EGABA 値 (n = 3 ～ 4 匹のラットからの 7 ～ 8 細胞)。 (P) siRNA 注射後の P7 ～ P10 での RMP 値 (n = 4 ～ 5 匹のラットからの 7 ～ 11 細胞)。（Q）siRNA注射後のP14〜P16における錐体ニューロンの10 mV増分で-80〜-30 mVの異なる保持電位で記録されたGABA誘導電流の電流電圧（IV）曲線。 (R) siRNA 注射後の P14 ～ P16 のすべての IV 曲線から得られた細胞あたりの EGABA 値 (n = 3 ～ 4 匹のラットからの 5 ～ 7 細胞)。 (S) siRNA 注射後の P14 ～ P16 での RMP 値 (n = 3 ～ 4 匹のラットからの 7 ～ 9 細胞)。 LPS：リポ多糖類。 NS:生理食塩水。 EGABA: GABA 逆転の可能性。パネル D、E、H、I、K、および L は、対応のない両側スチューデント t 検定によって比較されました。パネル O、P、R、および S は、反復測定とその後の Tukey 事後検定を伴う一元配置分散分析によって比較されました。 * P < 0.05、** P < 0.01、および *** P < 0.001、ns: 有意性なし。エラーバーはSDを示します

本研究は、新生児の重度の炎症が、GABA作動性の脱分極から過分極への移行の加速を伴い、新生児発育中のIL-1β/KCC2シグナル伝達の上方制御を介して、思春期のラットに長期にわたる認知障害を誘発する可能性があることを明らかにした。

中枢神経系の炎症は、幼少期の炎症に続く長期にわたる認知障害の発症に重要な役割を果たしていることが一般に認識されている[35、36]。炎症誘発性サイトカイン、特に IL-1β は、新生児炎症後の CNS 炎症プロセスにおいて重要な役割を果たします [16、17]。さらに、IL-1β は海馬に依存する記憶と学習に影響を与えることがよく知られています [37]。以前の証拠[10]と一致して、我々の結果は、IL-1βは、P3でのLPS注射後少なくとも生後30日まで高レベルで維持されるが、IL-6とTNFは維持されないことを示した。注目すべきことに、IL-1βの発現をノックダウンすると、新生児の炎症によって引き起こされる長期にわたる認知障害が大幅に軽減され、この障害におけるIL-1βレベルの持続的上昇が重要な役割を果たしていることが確認された。

GABA は、生後早期に未熟なニューロンを脱分極させます [38、39]。ニューロンの成熟中に、塩化物輸送体 KCC2 の上方制御により、GABA を介した脱分極から過分極への機能的変化が起こり、塩化物イオンの逆転電位の負の変化につながります [20、38、40]。このような発育期間中の侮辱は、長期的な影響を引き起こす可能性がある[27、40]。今回我々は、新生児の炎症がKCC2の発現を変化させ、それによって発達中のGABA作動性シフトに影響を及ぼし、それが長期にわたる認知障害の一因となる可能性があることを提案した。予想通り、我々の結果は、過分極したEGABAによって証明されるように、新生児の炎症によりKCC2の発現が増加し、したがって細胞内Cl-の濃度が低く維持されることを示しました。注目すべきことに、KCC2発現のノックダウンは、新生児の炎症によって引き起こされる認知障害を軽減し、過分極したEGABAを逆転させた。 KCC2がIL-1βの下流標的であるかどうかを決定するために、LPSラットにおけるIL-1β-siRNA注射後のKCC2発現およびEGABAを調べた。結果として、IL-1βの発現をノックダウンすると、変化したKCC2とEGABAの発現を元に戻すことができます。したがって、我々の発見は、発達中のKCC2の上方制御が、長期にわたる認知障害に対するIL-1βレベルの上昇の影響を媒介したことを示している。一方、コッラディーニら。ポリイノシン酸ポリシチジル酸（PolyI:C）による母親の感染は、子マウスの皮質におけるKCC2転写の下方制御を引き起こし、その結果、GABA作動性の興奮性から抑制性への移行が遅れ、in vivoでの発作に対する感受性が高まり、それが成体になるまで持続することを報告した。 [27]。これらの異常は、インターロイキン 1 受容体 I 型ノックアウトマウスでは観察されませんでした[27]。彼らの発見は、脳の領域と炎症の時間枠の違いから生じる可能性がある私たちの結果とは反対であるようです。以前の研究では、GABA作動性伝達の機能が皮質対海馬などの領域依存性であることが確認されている[18、19、20]。さらに、本研究で使用された高用量の LPS も、このような不一致の一因である可能性があります。要約すると、彼らの発見とここでの我々の結果は両方とも、発達中のIL-1β/KCC2とGABA作動性シフトとの間の関連性を示唆した。そして、GABA作動性の異常な変化（加速または遅延）が神経発達障害を引き起こす可能性があることを確認しました。

ゴメスら。 NKCC1の発現増加に起因する脱分極GABA逆転電位によって実証されるように、成体雄マウスにおいて幼少期の炎症がCA1錐体ニューロンの興奮性を増加させることを発見した[13]。したがって、彼らの発見と我々の結果は両方とも、いくつかの矛盾はあるものの、初期の炎症後の海馬ニューロンにおける長期持続する内在膜特性における塩化物恒常性の役割を強調している。今回の研究では、新生児の重度の炎症誘発性の長期認知障害において有意な性差は観察されませんでした。さらに、我々の結果は、KCC2の上方制御が原因となっている役割を果たしていることを示した。 LPS 投与の時点が矛盾の主な原因である可能性があります。Gomez の研究では新生児炎症は生後 14 日目 (P14) に LPS 注射によって誘発されました [13] が、この研究では LPS は P3 に注射されました。ゴメスらの研究では、 [13]、CA1 海馬錐体ニューロンからのパッチ記録は、青年期 (P35 ～ P45) または成人期 (P60 ～ P70) に行われ、脱分極した EGABA を示しました。この研究では、パッチ記録は P7 ～ P10 および/または P14 ～ P16 で記録され、過分極した EGABA を示しました。以前の証拠は、GABA作動性シフトがP14以降にほぼ完了した可能性があることを示していました[20]。したがって、GABA作動性シフトの初期段階で誘発された炎症と、ほぼ完全な段階で誘発された炎症では、異なる結果が生じる可能性があります。さらに、思春期に近い高齢者の炎症は、性別依存の認知障害を引き起こす傾向がある可能性があります。注目すべきことに、上述したように、本研究で使用されたより高い用量のLPSも、そのような不一致の一因である可能性がある。 Gomez の研究 [13] や別の研究 [41] における LPS の用量 (0.1 mg kg-1、腹腔内) とは異なり、より高用量の LPS (1 mg kg-1、腹腔内) を使用した結果、〜 40%死亡。したがって、このような高用量の LPS は、新生児の炎症ではなく敗血症モデルに似ています。重要なことに、我々は行動実験を実施し、KCC2の上方制御とGABA作動性シフトの加速が新生児炎症によって誘発される認知障害の重要な要因であることを実証した。限界は、Gomez らによって報告されているように、同様の効果が成体ラットで見られるかどうかをテストしていないことです [13]。新生児炎症の影響が特定の時間枠に限定されるかどうかを調査するには、今後の研究が必要です。

KCC2 に加えて、NKCC1 も未熟な脳のニューロン発達において極めて重要な役割を果たしています [18、42]。 NKCC1 は、さまざまな神経変性疾患の重要な治療標的であることが示唆されています。たとえば、統合失調症のマウスモデルにおける認知障害は、NKCC1の発現増加に起因する辺縁下前頭前野の錐体ニューロンにおけるGABAA電流の逆転電位と関連しており、これはブメタニドによって改善される可能性がある[43]。ダウン症候群のマウスモデルでは、in vivo での NKCC1 ノックダウンにより、さまざまな行動課題における認知障害が回復します [44]。遺伝的てんかんマウスモデルでは、脆弱な発育期にNKCC1アンタゴニストであるブメタニドで治療するとてんかんが回復する[45]。さらに、Gomezらは、海馬ニューロンにおける初期の炎症誘発性の内因性膜特性におけるNKCC1の役割を確認した[13]。しかし、ある研究では、終脳グルタミン酸作動性ニューロンのNKCC1が海馬の発達の主要な側面に必須ではないようであることが明らかになった[46]。今後の研究では、新生児の炎症誘発性認知障害における NKCC1 の役割を決定することが興味深いでしょう。

本研究では、海馬依存性の文脈依存性と海馬非依存性の手掛かり恐怖条件付けの両方についてラットをテストした[47]。新生児の重度の炎症は海馬に依存した状況依存的な影響を及ぼしたが、恐怖条件付けの手がかりには影響を与えなかった。これらのデータは、海馬に依存するモリス水迷路認知テストによって検出された空間学習および記憶の結果と合わせて、新生児の重度の炎症によって引き起こされる長期にわたる認知障害における海馬の重要性を強調しています。

新生児炎症後の青年ラットでは、KCC2とEGABAの発現が対照レベルに戻ったため、行動測定時の長期認知機能障害の直接の原因は何なのかという疑問が生じた。今回の研究では直接的なデータは提案されていないが、KCC2は、主に神経成熟中のGABA電流の強度と極性の設定、C末端を介した細胞骨格動態の調節など、認知機能に関連する神経発達において多面的な調節的役割を果たしている可能性がある。このドメインは、発生のアポトーシスを調節し、初期のネットワーク事象を制御するだけでなく、皮質樹状突起スパインの形成と可塑性に関与している[18]。したがって、上記のいずれかの機能の異常は、新生児の炎症によって誘発される長期の認知障害の一因となる可能性があります。例えば、幼少期の炎症および/またはGABA作動性シフトが興奮性グルタミン酸作動性伝達の発達に影響を及ぼし[20、48]、その結果、青年期のグルタミン酸作動性機能の障害につながる可能性がある。発達初期における KCC2 の上方制御がなぜ青年期、さらには成人においても長期的な認知障害を引き起こすのかを調査するには、今後の研究が必要です。

妊娠中の母動物に対する輸送の影響がよく知られていることに留意する必要がある[49、50]。したがって、妊娠中の母動物の輸送は発生研究には推奨されず、今後の実験では避けるべきです。この研究では、対照と炎症を起こした子犬の母犬の両方が輸送に等しく曝露されましたが、輸送ストレスと LPS 誘発炎症との相互作用が存在する可能性があります。

要約すると、我々の結果は、新生児重度炎症モデルにおけるIL-1β/KCC2の発現と長期持続する認知障害との間の機構的関連を強調し、早期敗血症性炎症後の認知障害を予防および/または治療するための根本的な分子標的を提供する。

現在の研究中に使用および/または分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

中枢神経系

GABA逆転の可能性

酵素免疫測定法

恐怖条件付け

γ-アミノ酪酸

インターロイキン 1 ベータ

K+-Cl- 共輸送体 2

リポ多糖類

モリス水迷路

Na+-K+-2Cl- 共輸送体 1

生理食塩水

産後3日目

静止膜電位

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適用できない。

この研究は、中国国立自然科学財団からの助成金番号 82071687 (Han Huang 宛) および No. 81974164 (Cheng Zhou 宛) によって支援されました。中国博士研究員科学財団からの助成金番号 2021M692276 (Donghang Zhang 宛)。四川省保健委員会プログラムからの補助金番号 21PJ014 (張東章宛)。

Donghang Zhang、Yujiao Yang、Yaoxin Yang もこの研究に同様に貢献しました。

四川大学西中国病院麻酔科、成都、610041、中国

Donghang Zhang、Yaoxin Yang、Jin Liu、Tao Zhu

610041 中国、成都、四川大学西中国病院、国家地方共同エンジニアリング研究センター、麻酔学のトランスレーショナル医学、麻酔および救命救急医学研究室

Donghang Zhang、Yaoxin Yang、Jin Liu、Cheng Zhou

麻酔科、北四川医科大学付属病院、南充、637000、中国

ヤン・ユージャオ

教育省、麻酔科および女性と子供の先天異常および関連疾患の主要研究室、四川大学西中国第二病院、成都、610041、中国

ハン・ファン

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CZ と HH は研究デザインに貢献しました。 DZ、YY1、および YY2 は研究の実施に貢献しました。 CZ、DZ、JL、TZ がデータ分析に貢献しました。 CZ、DZ、HH が原稿を作成しました。著者全員が原稿を修正しました。著者全員が最終原稿を読んで承認しました。

漢黄または程周との通信。

実験プロトコルは、四川大学西中国病院の動物倫理委員会（参照：2020013）（中国四川省成都）の動物倫理委員会によって承認され、動物研究：生体内実験の報告（ARRIVE）ガイドラインに従って実施されました。この研究には人間は含まれていませんでした。

適用できない。

著者らは、競合する利益を持たないことを宣言します。

シュプリンガーネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

ウェスタンブロッティング結果の元の画像。

テーブル。 S1: 図 1 の統計情報。 S2: 図 2 の統計情報。 S3: 図 3 の統計情報。 S4: 図 4 の統計情報。 S5: 図 5 の統計情報。 S6: 補足図 1 の統計情報。表。 S7: 補足図 2 の統計情報。表。 S8: 補足図 4 の統計情報。表。 S9: 補足図 5 の統計情報。表。 S10: 補足図 6 の統計情報。表。 S11: 補足図 7 の統計情報。

図 S1: 新生児炎症後の雄および雌ラットの MWM タスクと FC テスト。図 S2: LPS 曝露後の P7、P14、および P30 における海馬 IL-1β のタンパク質レベルを示すウェスタンブロッティングの結果。図 S3: IL-1β-siRNA または KCC2-siRNA によってもたらされる蛍光を示す代表的な画像。図 S4: 雌雄ラットの発生に伴う海馬 KCC2 の mRNA およびタンパク質レベル。図 S5: siRNA 注射後の P7、P14、および P30 ラットにおける海馬 IL-1β および KCC2 の mRNA レベル。図 S6: siRNA 注射後の P7、P14、および P30 ラットの海馬 IL-1β のタンパク質レベル。図 S7: siRNA 注射後の P7、P14、および P30 ラットの海馬 KCC2 のタンパク質レベル。

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転載と許可

Zhang, D.、Yang, Y.、Yang, Y. 他新生児の重度の炎症は、発達初期における IL-1β/KCC2 シグナル伝達の活性化によって長期的な認知障害を引き起こします。 BMC Med 20、235 (2022)。 https://doi.org/10.1186/s12916-022-02434-w

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受信日: 2022 年 3 月 7 日

受理日: 2022 年 6 月 13 日

公開日: 2022 年 7 月 27 日

DOI: https://doi.org/10.1186/s12916-022-02434-w

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