ノベルベネティン

Scientific Reports volume 12、記事番号: 18497 (2022) この記事を引用

1404 アクセス

1 引用

3 オルトメトリック

メトリクスの詳細

本研究は、Dendrobaena veneta ミミズの体腔液から得られたタンパク質-多糖複合体 Venetin-1 の A549 がん細胞に対する抗腫瘍活性を示しています。この研究は、この種から得られた体腔液の抗腫瘍活性に関する実験の継続です。ベネチン-1 ナノ粒子は、体腔液の熱処理、体腔細胞からの分離、濾過、および凍結乾燥の後に得られました。この製剤は癌細胞に対して選択的な効果を示しましたが、正常細胞には影響がありませんでした。ベネチン-1は、31.3および62.5μg/mlの用量で肺がん細胞に対して有効であり、その結果は光学顕微鏡および走査型電子顕微鏡(SEM)を使用して画像化された。細胞は主にアポトーシス経路を介して死滅しました。顕微鏡観察では、壊死細胞が散発的に現れた。 SEM イメージングにより、Venetin-1 とのインキュベーション後の A549 細胞の完全な破壊が明らかになりました。原子間力顕微鏡 (AFM) 分析により、Venetin-1 とのインキュベーション後の A549 細胞のトポグラフィー、ピークフォースエラー画像、およびヤング率 (弾性) の変化が示されました。透過電子極低温顕微鏡法 (Cryo-TEM) 分析により、分析された調製物のポリマー的性質が示されました。 Venetin-1 のサンプルは、微粒子サイズが約 58.23 nm の非常に均一なサイズプロファイルを示しました。スフィンゴミエリンへのベネチン-1の結合の有意な減少が観察されました。 Venetin-1 は細孔形成活性を失うか、または細孔形成活性の失活が起こりました。これは、赤血球に対するベネチン-1 の溶血能力が存在しないことを裏付けています。実施された分析は、得られた複合体の生物医学研究への適合性を示しています。次のステップは、マウスの免疫系に対するベネチン 1 の効果の分析で構成されます。

非感染性疾患のグループでは、がんが最も一般的な死因です。肺がんは、世界中で男性と女性の死亡率が最も高いのが特徴です1,2。喫煙は肺がんの発生の最も一般的な原因です。タバコの煙には約 4,000 種類の物質が含まれており、そのうち約 50 種類の化合物が有毒、刺激性、または発がん性があると分類されています1、3、4。受動喫煙にさらされた人も肺がんのリスクがあります。ニコチンの代謝物は受動喫煙者の尿から検出でき、これは非喫煙者がタバコの煙のさまざまな成分を吸入していることを示しています3。タバコの煙の成分は、細胞ゲノムの障害、例えば DNA の欠失や増幅、不正確なメチル化、さらには染色体全体の喪失や増加などを引き起こします2。

肺がんの 85% は喫煙者に発生しますが、他の症例は喫煙したことがない人に診断されます。肺がんの非タバコ原因の 1 つは大気汚染で、主に硫黄酸素、窒素酸素、または直径 2.5 μm 未満の粉塵の存在が原因です 5,6。米国では、肺がんの主な原因はラドン、つまり土壌中に存在するラジウム崩壊の生成物です。このガスは癌による死亡の 40% の原因であり、これらの患者のほとんどは生涯非喫煙者です1。研究者らはまた、肺がん発症に対する感受性の原因となる遺伝子、すなわち、p53およびEFGR遺伝子の生殖系列変異、SNP遺伝子多型、またはERCC12,7などのDNA修復遺伝子の障害を同定した。

肺がんは約 70 歳の人で診断されます。それらは、SCLC (小細胞肺癌) と NSCLC (非小細胞肺癌) の 2 つの主なタイプに分類できます。肺がんの約 85% は NSCLC2 です。発見が遅く、癌の進行段階が進行しているため、多くの場合、予後は不良です8。 SCLC は多くの場合、より大きな気道に位置し、気管支閉塞を引き起こします。これらのがんは非常に大きく、リンパ節に転移することがよくあります9。

天然の植物、真菌、動物由来の多くの化合物が肺がん細胞を破壊できることが証明されています。例えば、Ocimum sanctum からのバジル抽出物は、A549 肺がん細胞に対して細胞毒性を示し、サブ G1 集団を増加させ、がん細胞におけるアポトーシス小体の出現に影響を与えました 10。他の研究では、フィランサスが A549 細胞に対して選択的毒性を誘導できることが示されました。さらに、遊走や浸潤などの転移の重要な段階で抑制効果を発揮しました11。次に、Ramalakshmi et al.12 は、A549 肺がん細胞に対するコレウスアンボイニカスの葉からのエタノール抽出物の細胞毒性活性を発見しました。 A549 肺がん細胞と 72 時間インキュベートした後の細胞毒性は 94% でした。

Wei-Sheng ら 13 は、海洋菌類由来のボストリシン (ヒドロキシ-メトキシ-テトラヒドロ-5-メチルアントラセン) が、用量および培養時間依存的に A549 細胞の増殖を阻害し、細胞周期を G0/G1 で停止させ、アポトーシスを刺激します。 Theissenia rogersii 真菌から単離されたピクニジオンは、G1 期での細胞周期停止を介して A549 肺腺癌細胞の増殖を減少させることが示されました。さらに、外部および内部経路を介してアポトーシスを刺激することが判明しました。ピクニジオンはまた、A549 細胞においてミトコンドリア膜電位の低下と、活性酸素種およびタンパク質 PAI-1 のレベルの大幅な増加を引き起こしました 14。中国医学では、霊芝種から単離された化合物の抗がん特性は、肺がんに対する効果はよく知られています15。

動物由来の調製物に関して、Arulvasu et al.16 は、イワシ (Sardinellalongiceps) 油エマルジョンがアポトーシスを誘導し、用量および培養時間依存的に A549 肺癌細胞の増殖を阻害することを示しました。 Ω-3 酸の考えられる作用機序は、細胞膜との相互作用と、新生物細胞のアポトーシスを引き起こす膜酵素の阻害にあります。無脊椎動物に関しては、ミミズの体腔液由来のタンパク質も、たとえば肺がんなどに対して抗腫瘍活性を示すことが観察されています17。

ミミズは抗がん物質の供給源です。これらの環形動物は、火傷、喘息、気管支炎、心血管疾患、胃腸潰瘍などの多くの病気の治療に、ベトナム、中国、韓国などの極東医学で使用されています17、18。豊かな微生物叢があり、微生物とミミズが常に接触している生息環境の中で、これらの動物は病気の発症を防ぐメカニズムを進化させてきました18、19、20、21。ミミズから作られる最も一般的な製剤は粉末とペーストです20、21、22、23、24。体腔液にはタンパク質、酵素、ペプチド、多糖類が豊富に含まれていることが証明されています。線維素溶解特性があり、血管弛緩効果を発揮し、肝臓に有益な特性を持っています17、18、22。ミミズ製剤は抗菌性および抗真菌性を実証しています20、21、24、25、26、27、28。現在の研究では、体腔液が HeLa、A549、Pa17、PC-12、または Hep-2 癌細胞株に対して抗癌活性を有することが実証されています 20、26、29。細胞によるグルコース取り込みの制限に基づいた、癌細胞に対する体腔液の作用機構が提案されている 20。さらに、体腔液はヒトの線維芽細胞や赤血球に対して細胞毒性を持たないことが示されています 25,30。これらの特性により、ミミズ由来の製品はがん治療に有望な薬剤となります。

BEAS-2B および A549 細胞の増殖に対する Venetin-1 の効果は、24、48、および 72 時間の MTT アッセイを使用して測定されました (図 1)。 A549 細胞株は、さまざまな濃度の Venetin-1 (15.6 ～ 500 μg/mL) に 24 時間および 48 時間曝露した後では約 80 ～ 90% 生存率がありましたが、72 時間のインキュベーション後の生存率は 52% に大幅に低下しました。 Venetin-1 濃度 125 μg/mL、250 μg/mL、および 500 μg/mL では、それぞれ、41%、および 32% でした (図 1A)。 BEAS-2B 細胞の生存率は、500 μg/mL の Venetin-1 処理グループでは 72 時間で 75% に減少しました (図 1B)。より低い濃度では、BEAS-2B 細胞はより高い Venetin-1 耐性を示し、他のすべての Venetin-1 濃度では 72 時間後の生存率が高くなりました (80 ～ 100%)。

MTT アッセイの結果と指定濃度の Venetin-1 の効果。 (A) 24 時間、48 時間、および 72 時間のインキュベーション後の A549 細胞におけるベネチン-1 の用量反応曲線。 (B) 72 時間のインキュベーション後の肺癌 A549 細胞と正常 BEAS-2B 細胞に対する Venetin-1 の細胞傷害活性の比較。データは、3 回の独立した実験からの平均値 ± 標準偏差 (SD) として表示されます。 *p < 0.05; **p < 0.01。 72 時間のインキュベーション後の 125 ～ 500 μg/mL の濃度のベネチン-1 は、A549 細胞の生存率の大幅な低下を引き起こしましたが、BEAS-2B 細胞の生存率には大きな変化を引き起こしませんでした。

Venetin-1 抽出物によって誘導されるアポトーシス細胞死は、アネキシン V-FITC/PI アッセイを使用してホスファチジルセリン (PS) 転座をモニタリングすることによって調査されました。アネキシン V が生細胞の内膜リーフレットに局在する PS に結合する能力に基づいて、細胞を次のように分類しました: LL - 生細胞 (アネキシン V-/PI-)、LR - 初期アポトーシス細胞 (アネキシン V+/PI-)、UR - 後期アポトーシス細胞 (アネキシン V+/PI+)、および UL - 壊死細胞 (アネキシン V-/PI+)。

Venetin-1 による 72 時間の処理が A549 細胞に壊死およびアポトーシスの影響を及ぼしたことが観察されました (図 2)。生細胞数は、125 μg/mL の Venetin-1 と 72 時間インキュベートした後、対照の 77.03 ± 2.62% から 48.41 ± 0.92% に大幅に減少しました。対照細胞と比較して、Venetin-1 処理 A549 細胞では、壊死細胞 (約 5%) および初期アポトーシス細胞 (約 3%) の増加が観察されました。さらに、細胞は、未処理の細胞と比較して、著しく高い後期アポトーシス率を示しました（24.31 ± 0.57 対 2.18 ± 0.27）（表 1）。正常肺上皮細胞（BEAS-2B）に対するベネチン-1の活性の結果は補足資料に示されています（補足図S1）。

A549 細胞における Venetin-1 のアポトーシスおよび壊死活性をアネキシン V/PI 染色アッセイで評価しました。パネル (A) は、アネキシン V-FITC および PI で二重染色した後の A549 対照細胞 (ベネチン-1 とのインキュベーションなし) の代表的なドットプロットを示します。パネル (B) は、A549 細胞の細胞アポトーシスに対する Venetin-1 (125 μg/mL) との 72 時間のインキュベーションの効果を示しています。細胞は、生存細胞 (左下の四角)、初期アポトーシス細胞 (右下の四角)、後期アポトーシス細胞 (右上の四角)、および壊死細胞 (左上の四角) に分類されました。 3 つの独立した実験の代表的な画像が示されています。ベネチン-1 は、A549 細胞に対して壊死およびアポトーシスの影響を及ぼしました。 Venetin-1 で処理した A549 細胞における壊死率、ならびに初期および後期アポトーシスの割合は、対照よりもそれぞれ 5%、3%、および 22.13% 高かった。

細胞周期に対する Venetin-1 処理の潜在的な効果を調べるために、A549 細胞を 125 μg/mL の Venetin-1 で 72 時間処理し、PI で染色し、フローサイトメトリー分析を行いました。図 3 に示すように、処理された A549 細胞はサブ G1 期で停止し、アポトーシス細胞数が大幅に増加しました (p < 0.0001) (1.13 ± 0.08% vs. 36.63 ± 0.61%)。 Venetin-1 とのインキュベーションは、G1 (40.94 ± 0.94% 対 30.44 ± 0.57%、p = 0.0001)、S (25.56 ± 0.65% 対 18.36 ± 0.50%、p) での細胞の割合の同時減少も引き起こしました。 = 0.0001)、対照と比較した、処理された A549 細胞における細胞周期の G2/M 期 (31.36 ± 0.35% vs. 15.32 ± 0.38%、p < 0.0001)。

A549 細胞周期相に対する Venetin-1 処理の効果。 (A) A549 コントロール細胞および Venetin-1 (125 μg/mL) で 72 時間処理した細胞におけるフローサイトメトリーによる細胞周期分析。 PI 標識細胞の細胞周期分布をフローサイトメトリー分析によって分析しました。図のピークは、細胞周期のサブ G1 (ゲート M1)、G1 (ゲート M2)、S (ゲート M3)、および G2/M (ゲート M4) 期に対応します。 (B) 細胞周期の各段階における細胞の割合を示すヒストグラム。結果は、3 つの独立した実験からの平均 ± SD 値として表されます。対照群と比較して、0.05 未満の P 値 (*p < 0.05、**p < 0.01) は、統計的に有意であるとみなされます。 Venetin-1 処理により、サブ G1 期で A549 細胞が停止し、アポトーシス細胞数が増加し、他の細胞周期期では処理 A549 細胞とコントロール A549 細胞の割合が目に見えて減少しました。

カスパーゼ 3、6、8、9、12、および 18 のレベルを、Venetin-1 の存在下および非存在下で正常および腫瘍細胞のホモジェネートで測定しました (図 4)。 A549 肺がん細胞の培養において、試験した各カスパーゼのレベルは、125 μg/mL の濃度でベネチン-1 を添加した培養の方が未処理の培養よりも高かった。 125 μg/mL の濃度で Venetin-1 を添加した正常 BEAS-2B 細胞の培養物中のカスパーゼのレベルは、2 つの研究グループ間で有意な差はありませんでした。

BEAS-2B および A549 細胞培養物中のカスパーゼ 3、6、8、9、12、および 18 の濃度。 *p < 0.05。試験したカスパーゼ濃度の最大の増加は、Venetin-1 で処理した A549 肺癌細胞の培養で観察されました。

ベネチン-1 (125 μg/mL) とのインキュベーション後、A549 肺癌細胞の培養物でカスパーゼ 3、6、8、および 9 の濃度の最大の増加が記録されました。カスパーゼ 12 濃度の最も高い増加は、活性化合物とインキュベートした A549 肺癌細胞培養物で記録されました (図 4)。 Venetin-1 (125 μg/mL) を添加した BEAS-2B 細胞の培養では、カスパーゼ 12 の濃度のわずかな減少が認められました。 Venetin-1 とのインキュベーション後のカスパーゼ 18 濃度の最大の増加は、A549 肺癌細胞の培養において認められました。 Venetin-1 とインキュベートした正常細胞の培養物では、カスパーゼ 18 の濃度のわずかな減少が観察されました。完全なデータは補足資料 (補足表 S2) で入手できます。

A549 対照培養物と 62.5 および 125 μg/mL の Venetin-1 とインキュベートした変異体の分析により、活性画分で処理した細胞はレンズの下であまり目立たず、変形していることが示されました。細胞変性変化が細胞内で頻繁に観察されました。さらに、強く分解または崩壊している細胞が見られました（図5a）。

透過光顕微鏡および蛍光顕微鏡を使用したベネチン-1処理A549細胞の視覚化：（a）A549に対するベネチン-1の細胞毒性効果。 A - A549 対照培養物、B - 細胞毒性 78% で Venetin-1 (62.5 μg/mL) と 72 時間インキュベートした後の A549。 C1、C2 - 細胞毒性 48% で Venetin-1 (125 μg/mL) と 72 時間インキュベートした後の A549。細胞は、Zeiss Axiovert 40CFL 顕微鏡 (Carl Zeiss) を使用して視覚化されました。スケールバーは20μmに相当します。画像は 10 枚の画像を表します。 Venetin-1 で処理した細胞は変形し、劣化していました。 (b) Venetin-1 と 72 時間インキュベートした後の A549 細胞に対するアポトーシスおよび壊死の影響。 A - A549 の対照培養物、B - ベネチン-1 (62.5 μg/mL) で処理した A549 細胞、C1、C2 - ベネチン -1 (125 μg/mL) で処理した A549 細胞。黄色の矢印は、核の明らかに進行性の変性を伴うアポトーシス細胞を示します。ピンク色の細胞は壊死していると考えられます。スケールバーは 50 μm に対応します。各画像は 10 枚の撮影された写真を表します。

透過光学顕微鏡で観察された培養物は、壊死細胞およびアポトーシス細胞を識別するために蛍光色素の混合物を適用した後、共焦点顕微鏡を使用して画像化することもできました。対照細胞は、規則的な暗い蛍光核によって特徴付けられました。 62.5 μg/mL および 125 μg/mL の濃度の Venetin-1 とインキュベートした細胞は、頻繁に断片化された遺伝物質を含む明るい発光核を持っていました。アポトーシスの兆候を示す細胞は、画像内で矢印でマークされています。壊死細胞は散在し、赤色蛍光を発しました（図5b）。

対照培養物および 125 μg/mL の濃度の Venetin-1 とインキュベートした細胞を、DIC 技術を使用して観察しました。この技術により、立体的な表面の効果が確実に得られます。対照のA549細胞は、より濃い色および観察された表面のより多様な多様性によって示されるように、顕微鏡観察で目に見えてより高密度でコンパクトであることが観察された(図6a A)。 Venetin-1 処理後、細胞は収縮しました。これは、細胞の中心に近い細胞表面の濃い色の色素沈着によって証明されました (図 6a B1、B2)。腫瘍細胞の走査型電子顕微鏡検査により、対照群とベネチン-1 インキュベーション (125 μg/mL) グループ間の腫瘍細胞の表面の比較が容易になりました。対照細胞の表面には微細な顆粒構造が豊富にありましたが（図6a A1、A2）、一方、Venetin-1処理細胞にはこれらの顆粒がなく、細胞表面には損傷した構造の残骸が見られました（図6b B1、B2）。）。細胞収縮効果は、顕微鏡画像で識別可能な亀裂としても見ることができました (図 6b B1)。

Venetin-1 への曝露後の A549 細胞の DIC および SEM 分析: (a) Venetin-1 処理後の A549 細胞の DIC 画像 A - A549 の対照培養物 B1、B2 - Venetin-1 (125 μg/mL) とのインキュベーション後の A549 細胞）。スケールバーは 20 μm に相当します。 (b) Venetin-1 処理後の A549 細胞表面の SEM 画像。 A1、A2 - A549 の対照培養物、B1、B2 - Venetin-1 (125 μg/mL) とインキュベートした後の A549 細胞。スケールバーは 10 μm に相当します。 Venetin-1 とのインキュベーション後、A549 細胞の表面に細胞構造の収縮と分解が見られました。各画像は 10 枚の撮影された写真を表します。

125 μg/mL の Venetin-1 とともにインキュベートした A549 細胞の表面で AFM によって取得されたトポグラフィー画像とピークフォースエラー画像は、対照細胞 (図 7A1、A2) との違いを明らかにしました (図 7B1、B2)。高さ測定に供されたA549対照細胞の平均振幅は、Venetin-1処理細胞の平均振幅よりも2倍低かった。 Venetin-1 とインキュベートした A549 細胞は、高さプロファイルに目に見えるくぼみがあり、著しく変化した表面を持っていました (図 7B1、B2)。弾性が最も低い細胞表面積と最も高い細胞表面積を決定するために、ヤング率マップが作成され、指定された領域のヤング率値が比較されました。弾性が最も大きい領域のヤング率の平均値は、対照では 2120.7 MPa、Venetin-1 処理 A549 細胞では 1142.8 MPa でした。弾性が最も低い領域のヤング率は、Venetin-1 とインキュベートした A549 細胞では対照細胞 (6300.9 MPa) よりも 2.3 倍低かった (2647.4 MPa)。どちらの場合も、差は統計的に有意でした (p < 0.001; Student の T 検定)。 AFM 画像は、Venetin-1 処理によって引き起こされた A549 細胞のアポトーシスの形態学的および生物物理学的変化を示しました。

A549細胞壁表面のAFM分析。 (A1、A2) A549 の対照培養物、(B1、B2) 125 μg/mL の Venetin-1 とインキュベートした癌細胞。高高度とピークフォースエラーの画像 - 左パネル。高さプロファイルと 3D 画像 - 右パネル。 Venetin-1 処理により、A549 細胞の細胞壁トポグラフィーと機械的特性が変化し、ヤング率として表される弾性の大幅な低下が観察されました。

Venetin-1 および DVr (生の体腔液) のタンパク質成分を酵素消化する前に、サンプルを DTT で還元し、SageELF 自動システムで電気泳動分離に供しました。タンパク質は、10 ～ 300 kDa の範囲のサイズベースモードで分離されました。分離後、システムはタンパク質をゲルからカセット内の別々のウェルに自動的に溶出し、そこからタンパク質をエッペンドルフチューブにピペットで移し、FASP プロトコールに従って消化しました (各画分は個別に)。各画分におけるベネチン-1のタンパク質同定結果を表2に示します（すべての結果は補足資料、ベネチン-1については表S3、生の体腔液DVrについては表S4で入手可能です）。同定は、Annelida 用の改訂されたタンパク質データベース (Uniprot) に基づいて実行されました。

ミミズから収集され、未処理（加熱および透析なし）の Venetin-1 調製物とその前駆体 DVr（生の体腔液）の 2 つの脂質、スフィンゴミエリンおよび POPC への結合を測定しました。 3 mM リポソーム溶液は、「材料と方法」セクションに記載の手順に従って調製しました。脂質は、タンパク質と脂質の相互作用を研究するために設計された L1 センサー上に堆積されました。次に、アルブミン溶液でセンサーをブロックした後、両方の調製物の結合手順を実行し、結合タンパク質を溶出してプロテオーム解析に供した。図 8 に示すセンサーグラムは、調製物の脂質への結合を示しています。未処理の DVr 調製物と比較して、スフィンゴミエリンへの Venetin-1 の結合が大幅に減少しました。 POPC 脂質への DVr の結合が低いことが検出されました。 Venetin-1 の POPC への結合は弱く、複合体からの素早い分離に関連していました。

SM (スフィンゴミエリン) および POPC (1-パルミトイル-2-デオイルphpスファチジルコリン) に結合するタンパク質抽出物 (DVr - 生の体腔液およびベネチン-1) の SPR 分析。観察された変化は、未処理の DVr 調製物と比較したスフィンゴミエリンへの Venetin-1 の結合の減少、POPC 脂質への DVr の結合の低下、POPC への Venetin-1 の結合の弱さに関連していました。

SPR 実験からの回収画分のプロテオミクス分析により、各ケースで 1 つのタンパク質、すなわちリセニン関連タンパク質 2 (LRP2) のみが同定されたことが示されました。 DVr では配列のカバー率が最も高く、ほとんどのペプチドが同定されました。詳細については、補足資料の表 S5 を参照してください。

活性化合物ベネチン-1は、走査型顕微鏡下でさまざまなサイズの小さなフレークとして観察できました。最も長い構造は長さが約 200 μm でした (図 9A1、A2)。プレパラートの構造も Cryo-TEM 技術を使用して観察されました。より小さな構造が集まって、より大きな円形構造を形成していることがわかりました。より小さな構造の蓄積は図９Ｂの白丸で示され、緩い構造は矢印で示されている。標本の上部にはコンパクトな丸い形状が見られます。観察された画像は、Venetin-1 構造が高分子化合物の特徴であることを示唆しています。

Venetin-1 のイメージング: (A1、A2) Venetin-1 の SEM 画像。 (B) Venetin-1 の Cryo-TEM イメージング。この画像には、小さな構造が大きな構造 (白丸でマーク) にグループ化されていることが示されています。緩い構造には矢印が付いています。画像の上部には、より小さな粒子で形成された暗い円形の緻密な構造が見られます。

分析の結果、炭素 (64.1%)、酸素 (23.5%)、窒素 (6.3%)、リン (1.6%)、および硫黄 (0.3%) の存在が示されました。これらすべての要素はタンパク質の特徴です。テストでは、塩素 (3.0%) とナトリウム (1.3%) の存在も示されました。

Venetin-1 の XPS 調査スペクトルを図 10 に示します。Venetin-1 表面の元素組成の XPS 分析の定量的結果を表 3 に示します。

Venetin-1 の XPS 調査スペクトル。炭素、窒素、リン、硫黄など、タンパク質に特徴的な元素が検出されました。さらに、塩素とナトリウムの存在が実証されました。

分析された調製物に存在する化学結合を特定するために、炭素、酸素、窒素、硫黄、リンの狭い範囲の結合エネルギーのスペクトルが取得されました。文献データに基づいてピックフィッティング操作を行った後、化学結合が個々の結合エネルギーに合わせて調整されました。図 11 は、狭い範囲の XPS 結合エネルギーにおけるスペクトルを示しています。表 4 は、特徴的な化学結合の同定とともに Venetin-1 の元素組成を示しています。

狭い範囲の結合エネルギーにおける Venetin-1 の XPS スペクトル: (a) 炭素、(b) 酸素、(c) 窒素、(d) リン、(e) 硫黄。

この研究では、多糖類とタンパク質の両方の結合特性が示されました。炭素の狭い範囲の結合エネルギーのスペクトルは、多糖類に C-C、C-H、C-OH、C=O、および C-O-C 結合が存在することを示しました。タンパク質に特徴的な O=C-OH カルボキシル結合の存在も観察されました。ペプチド結合に特徴的な C=O および C-N 基も見つかりました。窒素に特有の狭い結合エネルギー範囲で実施されたテストでは、窒素がアミン結合の形で存在することが示されました。これらの結合はタンパク質の特徴です。リンと硫黄の有機形態の存在も、試験した調製物中にタンパク質が存在することを裏付けます。

図 12 および表 5 に見られるように、サンプルは非常に均一なサイズ分析プロファイルを示し、微粒子サイズは 58.23 ± 3.93 nm であると測定されました。

Prometheus Panta による Venetin-1 微粒子の DLS サイズ分析。調製物はサイズプロファイルが均一であることが判明した。

Prometheus Panta を使用して行ったサイズ分析に続いて、25 ～ 95 °C の温度勾配と 1 °C/分の加熱勾配で融解温度実験を実行しました (表 6)。図 12 に示すように、微粒子は 64.95 ± 0.08 °C の温度で単一の 350/330 nm 遷移を示しました。この転移は、分析された微粒子の融点に相当する可能性が非常に高い。さらに、蛍光比 350/330 nm で表される構造変化の後、分析された微粒子は Tagg 66.92 ± 0.16 °C および凝集開始 58.97 ± 1.15 °C で凝集を起こしたことが判明しました。

動物由来の医薬品の再生可能な供給源、これらの供給源に基づく医薬品、および生物学的食品添加物は、効果的な治療薬の探索の進歩に不可欠な部分であると思われます。このような人間の活動はあらゆる方法で改善されるべきです。便利な動物モデルは、統合医療と呼ばれる補完代替医療の発展に貢献します。ミミズのような無脊椎動物は安価で、倫理的に議論の余地がなく、生物学的プロセスの根底にあるメカニズムを理解するのに役立ちます37。ミミズ由来の医薬品の使用は、中国や他のアジア諸国でグリーンメディスンとして高度に発展しています。これらの無脊椎動物から調製された抽出物は、多くの病気の治療に使用されます。無脊椎動物の中でも、ミミズは抗菌、抗真菌、抗がん化合物の供給源として知られています。ミミズの体腔の体腔液は、抗菌活性、タンパク質分解活性、溶血活性、血球凝集活性、抗真菌活性、抗腫瘍活性など、多くの種類の生物学的特性を示します。

私たちの研究は、以前はD. venetaミミズの体腔液からのタンパク質多糖画分として特徴付けられていたベネチン-1が、A549肺癌細胞に選択的な効果を持ち、癌細胞を破壊し、正常な細胞を救うことを示しています。調製物は、電気ショックによる液体の抽出、遠心分離、濾過、インキュベーション、凍結乾燥などのいくつかのプロセスを経て得られました。特に重要なステップは、腫瘍細胞に対する高い活性を維持しながら、正常細胞に対する液体の細胞毒性を奪うことでした。これらのプロセスは、A549 肺癌細胞に対する体腔液からの画分の作用を説明する出版物に記載されています 29。

得られた調製物はアポトーシス細胞死を引き起こした。現代の腫瘍学の観点から見ると、アポトーシスはがん細胞で活性化される非常に重要なプロセスです。がん細胞は本質的に不死です。現代の薬は、異常な細胞のみにアポトーシス（または他の種類の細胞死）を誘導し、体内の健康な細胞は無傷で残すように設計されるよう試みられています。言い換えれば、腫瘍は薬理学的に自殺するように誘導されます。アポトーシスプロセスの誘導は、設計された抗がん療法の主な目的の 1 つです。これは、プログラムされた死に対する腫瘍細胞の耐性の発達したメカニズムに関連しています。現在の化学療法薬は、主にアポトーシスの誘導によってがん細胞を殺します。しかし、腫瘍細胞が転移する可能性がある場合、それらは効果がなく、予後不良と高い死亡率に関連します 38。がん細胞は通常、アポトーシスのプロセスに影響を与えるいくつかの遺伝子変異を持っており、それによってプログラムされた細胞死を回避します。このアポトーシスに対する耐性は転移細胞にとって有益です38、39、40、41、42。

標的タンパク質はカスパーゼによってタンパク質分解され、その活性化または阻害が引き起こされる可能性があり、それによって細胞の将来の運命に重大な影響を与える可能性があります。それらは生物体内で多くの重要な機能を果たします。とりわけ、これらのタンパク質はアポトーシスにおいて重要な役割を果たします。さらに、それらはピロトーシス、ネクローシス、オートファジーなどの他の細胞死メカニズムにも関与しています。それらはまた、免疫系の機能や、炎症誘発性サイトカインの分泌の刺激による炎症過程においても重要です。それらは老化プロセスにも関与します。一部のカスパーゼは抗がん特性を持っています43、44、45、46、47。イニシエーターカスパーゼ (カスパーゼ 2、8、9、および 10) はアポトーシスの初期段階に関与しており、その役割は死シグナルを増強することです。それらはまた、エフェクターカスパーゼ (カスパーゼ 3、6、7) の活性化にも関与します。次に、活性化後、エグゼキューターカスパーゼは細胞要素を急速に分解します43、47、48。

本結果は、ベネチン-1が培養A549肺癌細胞においてカスパーゼ活性の統計的に有意な増加を引き起こすことを示している。エグゼキューターカスパーゼのグループに属するカスパーゼ 3 の濃度の増加と培養中の生細胞数の減少は、Venetin-1 の添加後にこれらの腫瘍細胞におけるアポトーシスプロセスが強化されたことを示している可能性があります。しかし、カスパーゼ 12 の増加は、この準備が炎症過程の誘導にも重要である可能性を示唆しています。カスパーゼ 6 の濃度の増加は、Venetin-1 がアポトーシスの実行段階に影響を与えていることを示し、カスパーゼ 8 および 9 の濃度の増加は、それらの開始段階への影響を反映しています。次に、BEAS-2B気管支樹の気管支上皮の正常細胞の培養物にベネチン-1を添加した後、試験したパラメータに有意な変化は見られなかった。

光学顕微鏡、走査型電子顕微鏡、および原子間力顕微鏡による観察により、Venetin-1 とのインキュベーション後の腫瘍細胞の形態およびナノメカニカル特性の変化が明らかになりました。異なる技術によって提供された顕微鏡画像は相互に補完し合いました。透過光学顕微鏡では、活性化合物とのインキュベーション後の細胞密度の減少と変形が示されました。粗さなどの A549 細胞表面パラメーターの変化は、原子間力顕微鏡によって検出されました。初期のアポトーシスは、細胞骨格と核の再構築によって特徴付けられます。それは細胞表面のナノメカニカル特性に動的な変化を引き起こします49。肉眼的には、培養密度の減少は DIC 技術によっても証明されました。

単離されたベネチン-1 は、A549 肺がん細胞のカスパーゼ 3、12、および 18 のレベルの大幅な増加を引き起こし、同時にこれらの培養細胞の生存率と細胞密度の変化を誘導しました。これは、この製剤が A549 肺癌細胞のアポトーシスプロセスを刺激することによって抗腫瘍効果を発揮することを示しています。

私たちの調製物をタンパク質-多糖画分として説明していますが、以前の電気泳動分析により、タンパク質から来るシグナルが糖から来るシグナルと正確に同じ位置に位置することが示されているため、実際には複合体です。これは、これらのタンパク質と糖化合物が互いに関連していることを示しています。さらに、FTIR 分光分析は、FTIR スペクトルが分析された各領域で同じに見え、同じ強度を持っていたため、調製物の化学的均一性を証明しました。複合体の性質を裏付けるもう 1 つの観察は、調製物の Cryo-TEM 画像です。これは、同一のより小さな構造がより大きな球形に融合していることを明確に示しています。化学結合の XPS 分析により、この理論が確認されました。さらに、プロメテウスパンタを使用して実行された動的光散乱ドメイン特異的分析により、これまでタンパク質多糖画分とみなされていたベネチン 1 が 1 つのナノ粒子であることが示されました。

抗真菌活性に関する研究で行われた以前の化学分析 27,28,30 では、リセニンファミリーのタンパク質であるリセニン関連タンパク質 2 (LRP2) とリセニンが、それぞれ 95% と 90% の配列カバー率の精度で同定されたことが示されました。は Venetin-1 の主成分でした。ライセニンは、ミミズの体腔液に含まれる 33 kDa のタンパク質です50。おそらく、リセニン mRNA が体腔細胞および遊離の葉緑細胞で発見されていることから、リセニンはこれらの細胞によって産生されると考えられます。ライセニンはスフィンゴミエリン (SM) に特異的に結合し、標的細胞の細胞膜に結合すると MS 依存的にオリゴマーを形成します。これらのタンパク質は孔形成毒素のグループに属しており、製剤の生物学的活性に関与している可能性があります。

SageELF (電気泳動側方分別) システムは、DVr と Venetin-1 のタンパク質成分の分離に使用されました。 SDS アガロースゲルマトリックス中での同時溶出によるタンパク質の分画に使用されます。ソフトウェアは、サンプル前処理ステップ中に追加された蛍光マーカーからのシグナルに基づいて分別時間を制御します。このようにして、得られた画分を分子サイズ 10 ～ 300 kDa に応じて分割しました。プロテオミクス分析により、すべての溶出液中にかなりの量の成分が存在することが確認されました。ベネチン-1 の場合、フラクション 9 (8 から 10 に溶出) で最大の割合を占めるのは、リセニン、アクチン 2、およびリセニン関連タンパク質 2 の単量体形態です。ただし、これが全体に存在する唯一の形態ではありません。準備。 PeaksStudio プログラムパラメーター (補足表 S3) によって推定されるこの形態の高頻度は、高分子量画分で観察され、そこから約 260 kDa (画分 1) から 100 kDa (画分 4) の重量を持つ分子が溶出されました。モノマーの質量をリセニンまたはLRP2の質量（33/34 kDa）と仮定すると、これらは、均一なリセニンである場合、またはリセニンとLRP2の混合物としての不均一なLRP2オリゴマーである場合、三量体から八量体である可能性があります。それらの配列は非常に類似しています (同一性 89%)。アクチン 2 (42 kDa) や、すべての画分で確認されたユビキチン断片などの存在により、それが多タンパク質複合体である可能性もあると考えられます。センサーグラム分析により、脂質との相互作用における Venetin-1 と DVr の違いが明らかになりました。 DVr のデータは、スフィンゴミエリンを特異的に認識するタンパク質としてライセニンを指摘する文献報告と一致しています51。 Venetin-1 の場合、スフィンゴミエリンへの結合の大幅な減少が観察されました。これは、このタンパク質の特徴である完全な細孔を形成する能力の喪失、または未処理の体腔液の加熱中に機能しないオリゴマーが形成されることを示唆している可能性があります。 Venetin-1 は依然として SM と相互作用できますが、相互作用ははるかに弱くなります。これは、哺乳類の膜を模倣した POPC の場合にも見られます。 DVr は SM よりも弱い効果を発揮しますが、Venetin-1 の場合の相互作用はさらに弱いです。回収画分からのタンパク質の同定により、試験した両方の調製物において、リセニン関連タンパク質 2 が脂質結合タンパク質であることが明らかになりました。 LRP-2 はリセニン配列に対して 89% の同一性と 94% の類似性を示し、文献データは、LRP が SM に結合し、リセニンと同様に赤血球の溶血を誘導することを示しています 51。構造的には、それらは推定上の N-グリコシル化部位と N-ミリストイル化部位を共有しています。結果は、Venetin-1 と脂質の相互作用は LPR2 に基づいており、リセニンには基づいていないことを示しています。

Venetin-1 は細孔形成活性を失ったか、または細孔形成活性の失活が起こりました。これは、赤血球に対するベネチン-1の溶血能力の欠如によって確認され、DVr調製物と比較して、健康な細胞に対するベネチン-1の毒性が大幅に減少し、赤血球の溶血が存在しないことが実証されました。 DVr 画分は RBC を分解しましたが、Venetin-1 とのインキュベーションはこれらの細胞を変化させず、内容物の放出も引き起こしませんでした (データは原稿には示されていません)。したがって、細孔や膜穿孔の形成を伴わない、単量体またはオリゴマー形態と膜表面との相互作用は、癌細胞においても類似している可能性がある。細孔形成プロセスは、膜と接触する 3 つの主なステップ、つまり可溶性モノマーの膜への結合、集合/オリゴマー化、および脂質膜への細孔形成の完全な組み込みで構成されます 52,53。ベネチン-1はモノマーまたはおそらく可溶性オリゴマーを膜に結合しますが、他の2つのステップは何らかの形で阻害されているようです。

現在の医学知識によれば、単独で、または他の薬剤と相乗して、非小細胞肺がんに対して効果的に作用する新しい薬剤を開発する必要が依然としてある。肺がんは、診断が手遅れになることが多いため、予後が非常に悪い新生物の 1 つです。ほとんどの癌の治療の基本は併用療法、つまり手術技術、放射線療法、化学療法の使用です。治療の種類は腫瘍の段階と患者の全体的な効率によって異なります。がん疾患および化学療法中に、重篤な合併症として真菌感染症が患者に発生する場合があります。この場合、抗がん細胞増殖抑制剤の活性と抗真菌薬との相互作用の両方を知ることが非常に重要です。腫瘍学で使用される抗真菌特性を持つ化学療法剤は、細胞増殖抑制剤のさまざまなグループに属します。これらには、白金誘導体代謝拮抗剤、DNA トポイソメラーゼ阻害剤、エストロゲン受容体モジュレーターが含まれます。タンパク質多糖画分として以前に記載されているベネチン-1 は、正常なヒトの皮膚細胞に対してエンド毒性や細胞毒性を示さずに、C. albicans に対して効果的な抗真菌活性を示しました 54。

A549 非小細胞肺癌細胞に対する抗腫瘍活性 29,55 に加えて、この画分は結腸癌細胞に対して細胞毒性効果を持っています 56,57。さらに、Venetin-1 は in vitro でヒトマクロファージを活性化し、これらの細胞による炎症誘発性サイトカイン (メッセンジャータンパク質) であるインターロイキン 6 (IL-6) およびインターロイキン 1β (IL-1β) の分泌を引き起こすことが示されています。この発明はポーランド特許庁によって特許を取得しました58。ベネチン-1は、感染に対する耐性を高める製剤の成分として（例えば、免疫刺激薬）、または局所的に免疫応答を増強する（例えば、細菌またはウイルスのワクチンに添加されるアジュバントとして）の成分として使用できます。研究では、ベネチン-1 が直接的な抗腫瘍活性を示すことが示されているため、示された免疫賦活効果は、免疫系の適切な機能を回復してがんと闘うために、または化学療法後の免疫不全を補うために、がん患者にベネチン-1 を使用できる可能性を示唆しています。

ミミズ D. veneta の抗菌および抗腫瘍活性を持つ活性因子の探索は、私たちの研究チームによって 10 年以上にわたって行われてきました。第 1 段階では、これらの研究により、この種の消化管から共生細菌 Raoultella ornithinolytica が分離されました。この細菌の細胞外代謝産物は、抗菌、抗真菌、および抗がん化合物を生成します59、60、61、62、63。活性剤を単離するには、クロマトグラフィー法による分離が必要です。十分な量の被験物質を入手することが困難であり、分離に高額な費用がかかることも制約でした。

次のステップは、体腔液から活性化合物を単離することを試みることでした。研究のこの段階は成功し、安価な方法で大量の活性物質が得られました。細胞毒性を除去するために、高温でのインキュベーション後に透析による分離を適用した。この場合、唯一の制限は自由に調整できる個体の数です。

Venetin-1 の取得方法は安価で、いつでも迅速に実行でき、商業利用に適しています。現在、生命倫理委員会の許可を得てマウスモデルで研究を行っており、近い将来、動物の免疫系を効果的に刺激する投与量が決定される予定です。製剤の損失を避け、有効用量を維持するには注射が最良の方法であると思われるため、製剤は注射によって腹腔内投与されます。免疫調節特性を決定した後、肺癌を患っている動物にベネチン-1を注射して、阻害効果を決定します。

今回の研究で確認された、D. veneta 由来の活性ナノ粒子の A549 肺がん細胞に対する抗がん効果により、肺がんに対する安全で効果的な薬剤の使用が可能になる可能性があります。そのような薬の開発は、この病気の治療における画期的な進歩となるでしょう。

Dendrabaena veneta ミミズは、マリアキュリースクウォドフスカ大学 (ポーランド、ルブリン) の免疫生物学部の実験室条件で増殖されました。無脊椎動物は、堆肥土壌を満たした 3 L の容器に入れ、完全な暗闇で 20 °C の温度で保管しました。ミミズには茹でた野菜と緑茶の葉を与えた。餌には繭を作るのに必要なリグニンセルロースが豊富に含まれていました。

腸を浄化するために、成体のミミズを湿ったリグニン上に 24 時間放置しました。次に、軽い電気刺激 (4.5 V) によって 10 匹のミミズ個体のグループから体腔液 (CF) を収集しました。 CFを0.9% NaCl中で採取し、2500×g、4℃で10分間遠心分離して体腔細胞を除去した。これにより細胞を含まない上清が得られ、これを孔径 0.22 μm のミリポアフィルターで濾過して滅菌しました。無細胞 CF を 70 °C で 10 分間インキュベートして、細胞毒性を除去しました。次に、カットオフ 12 ～ 14 kDa のセルロース膜バッグに移しました。サンプルを水中で 4 °C で 24 時間透析しました。透析後、Venetin-1を凍結乾燥した。調製物は-20℃で保存した。タンパク質濃度は、Bradford 法 (Bio-Rad、USA) を使用して凍結乾燥サンプルで推定されました 64。非加熱および非透析の体腔液 (生の体腔液 - DVr) をプロテオミクス分析に使用しました。

ヒト気管支上皮細胞 (BEAS-2B) および肺腺癌上皮細胞 (A549 細胞) を、8% FBS (Gibco、Invitrogen、米国) を含む RPMI 1640 培地 (Gibco、Invitrogen、米国) 中の 100 mm ポリスチレン組織培養皿で培養しました。 37 °C、5% CO2、95% 空気の加湿インキュベーター内で、5% ペニシリン/ストレプトマイシン (Gibco、Invitrogen、米国) を加えます。細胞はトリプシン処理によって定期的に継代され、2 × 105 の初期播種密度で 72 時間継代培養されました。 BEAS-2B 細胞は、マリア・スクウォドフスカ・キュリー記念がんセンターおよび腫瘍学研究所（ポーランド、グリヴィツェ）のドロタ・シチェグリンスカ博士によって研究のために提供されました。 A549 細胞は、ルブリン医科大学 (ポーランド) の細胞培養物から得られたものです。

メチルチアゾールテトラゾリウム (MTT) アッセイを使用して、BEAS-2B および A549 肺がん細胞に対するベネチン-1 の細胞毒性を測定しました。まず、細胞を 1 × 104 細胞/ウェルの密度で 96 ウェルプレートに播種し、CO2 インキュベーター内で 37 °C で 24 時間接着させました。翌日、培地を、さまざまな濃度の Venetin-1 (15.6、31.3、62.5、125、250、および 500 μg/mL) を添加した新しい培地と交換しました。各 96 ウェルプレートをコントロール (細胞のみ) グループとゼロ調整 (培地のみ) グループでセットアップしました。アッセイは三連で実施した。 24、48、および72時間後、培地を新しいものと交換し、細胞を20μLのMTT（Invitrogen、CA USA）作業溶液（5mg/μL）とともに37℃で4時間インキュベートしました。。次いで上清を除去し、紫色のホルマザン結晶を100μl/ウェルのジメチルスルホキシド(DMSO)に可溶化し、その後インキュベート(1時間)した。ホルマザン溶液の吸光度を、プレートリーダーVictor 1420マルチラベルカウンター(PerkinElmer, Inc. Waltham, MA USA)を用いて550 nmで測定した。細胞生存率は、次の式を使用して計算しました: [細胞生存率 (%) = (実験グループ OD − ゼロ調整グループ OD)/(対照グループ OD − ゼロ調整グループ OD) × 100%。細胞阻害率 (%) = 1 − 細胞生存率 (%)]。各実験を 3 回繰り返しました。

細胞アポトーシスを評価するために、A549 細胞を 2 × 105 細胞/mL の密度で 6 ウェルマイクロタイタープレートに播種し、24 時間増殖させました。次に、培地を新しい培地（コントロール細胞）と交換するか、細胞を 125 μg/mL の Venetin-1 に 72 時間曝露しました。集団内で積極的にアポトーシスを起こしている細胞のパーセンテージを決定するために、eBioscience™ Annexin V-FITC アポトーシス検出キット (Invitrogen、米国) をメーカーの指示に従って使用しました。簡単に説明すると、採取した細胞 (約 5 × 105 /mL) を 200 μL の結合バッファー (1x) に再懸濁し、室温で 10 分間インキュベートした後、195 μL の細胞懸濁液を 5 μL のアネキシン V-FITC と混合しました。次に、細胞を 200 μL の結合バッファー (1x) で洗浄し、190 μL の結合バッファー (1x) に再懸濁し、10 μL のヨウ化プロピジウム (PI) (20 μg/mL) で染色しました。暗所、室温で15分間インキュベートした後、細胞をGuava easyCyteフローサイトメーター(Merck、ドイツ)で分析した。細胞は、Merck Millipore の InCyte™ ソフトウェアを使用して分析されました。各サンプルについて 10,000 のイベントが分析され、結果は各カテゴリの細胞のパーセンテージとして表されました。 3 つの独立した実験が実行されました。

細胞周期の進行はPIを使用して決定されました。 A549 細胞は、細胞アポトーシスの評価のために上記のように調製されました。 72時間後、細胞を回収し、PBSで洗浄し、遠心分離(300g、6分、4℃)後、氷冷70%エタノールで4℃で一晩固定した。次に、細胞を PBS で 3 回洗浄し、細胞数を約 1 × 106 に調整し、メーカーの指示に従って FxCycle™ PI/RNase Staining Solution (Thermo Fisher, USA) で染色しました (37 °C で 15 ～ 30 分)。。サンプルは、Guava easyCyte フローサイトメーター (Merck、ドイツ) で分析されました。このゲート内の 10,000 のイベントがサンプルごとに取得されました。

この研究には、正常な BEAS-2B 細胞と A549 肺がん細胞の培養が含まれていました。培養は、Venetin-1 を添加しない場合と添加する場合の両方で、標準条件 (37 °C、5% CO2、湿度 90%) で実行されました。ヒト CASP ELISA キットを使用してカスパーゼの濃度を測定しました (FineTest、Wuhan Fine Biotech Co., Ltd.、中国)。カスパーゼ濃度は、製造業者のマニュアルに従ってELISAを使用して測定した。マイクロプレートリーダー(BioRad、USA)を使用して450nmでの吸光度値を読み取った。

コントロールおよびベネチン-1 (濃度 62.5 および 125 μg/mL) とともに 72 時間インキュベートした A549 がん細胞を、Zeiss Axiovert 40CFL 顕微鏡 (Carl Zeiss、ドイツ) を使用して画像化しました。それらの構造の変化は、DIC (微分干渉コントラスト) 機能によっても記録されます。細胞の形態は、Olympus BX61 顕微鏡 (Olympus Corporation, Japan) を使用して 60 倍の倍率で視覚化されました。

アポトーシスに特徴的な A549 腫瘍細胞形態の変化は、Hoechst 33342 蛍光色素と PI (Sigma、ドイツ) の混合物を使用した蛍光顕微鏡を使用して評価されました。対照細胞およびVenetin-1処理細胞を、Zeiss LSM 5 Pascal (Carl Zeiss、ドイツ) 顕微鏡を用いて、それぞれ〜460 nmおよび> 575 nmの発光波長で画像化した。 2.5μl/mLの濃度の染色混合物を細胞培養物に添加し、調製物を暗所で37℃で5分間インキュベートした。アポトーシスは、無傷の細胞または断片化した細胞の核の明るい青色の蛍光によって証明されました。ピンク色の核を持つ細胞は壊死していると特定されました。

Venetin-1 とのインキュベーション後、非小肺癌 A549 細胞を SEM で観察しました。まず、それらを、ｐＨ７．０の０．１Ｍリン酸緩衝液中の４％グルタルアルデヒドで固定した。続いて、細胞をスライド上にマウントし、1% OsO4 溶液で 1 時間染色し、続いて一連のアセトン溶液 (15%、30%、50%、70%、100%) で脱水しました。調製物をシリカゲルを使用してデシケーター内で２４時間乾燥させ、Ｋ５５０Ｘコーター（ＱｕｏｒｕｍＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、英国）を使用して金メッキした。固定された細胞は、Tescan Vega 3 走査型電子顕微鏡 (Tescan、チェコ共和国) を使用して分析されました。

Venetin-1 の構造は、Quanta 3D FEG 走査型電子顕微鏡 (FEI、日本) を使用して観察され、文書化されました。標準的な脱水および金スパッタリングを行っていない凍結乾燥標品を顕微鏡観察に使用した。この手順により、活性物質を自然な形状で視覚化することができました。

対照癌細胞およびベネチン-1処理細胞の表面をAFMにより分析した。測定は、MultiMode 8 (Bruker、Veeco Instruments Inc.) を備えた PeakForce Quantitative Nanomechanical Mapping モードで操作される NanoScope V AFM 顕微鏡を使用して実行されました。 NanoScope 8.15ソフトウェアを搭載しました。局所弾性係数は、Derjaguin-Muller-Toporov (DMT) 係数を使用して決定されました。 RTESPA プローブ (Bruker、USA) (窒化物レバー上のシリコンチップ) の公称バネ定数は 40 N/m でした。 A549 細胞表面の選択された領域のヤング率を測定しました。サンプルは、SEM について説明したように準備されました。ヤング率は、各サンプルの 20 視野 (剛性の低い暗い領域と剛性の高い明るい領域) について測定されました。データは統計的に分析されました。

Venetin-1 および生体腔液 (DVr) からのタンパク質の分離は、3% SDS-アガロースゲルカセット (ELP3010) 内の自動 SageElf システム (Sage Science、ビバリー、マサチューセッツ州、米国) の開発により実行されました。 10 ～ 300 kDa の範囲のタンパク質を分離できます。必要なすべての溶液 (ローディングバッファー) とマーカーはセット内のカセットに付属しています。サンプルをローディング溶液に溶解して、26 ml 中に 200 mg のタンパク質の濃度を得ました。次に、4 ml の 0.5 M DTT をサンプルに添加し、混合物全体を 85 °C で 6 分間加熱しました。冷却後、蛍光Marker-03を含むローディング溶液10mlをサンプルに添加し、サンプルを混合した。このようにして調製したタンパク質を3% SDS-Agaroseカセットに導入した。分離 (サイズベースモード) では、1 時間 20 分間、その後 30 分間、ゲルからタンパク質を自動溶出させました。システムは SageElf ソフトウェアバージョン 1.08 によって制御されました。それにより、調製物の 12 画分が得られ、次に標準的な FASP 手順とトリプシン (Trypsin Gold、Promega) を使用して消化されました 27,65。 2 回の実行から得られた画分を 1 つの FASP 手順に合わせました。最終的なクリーンアップは、Stage Tips の手順に従って実行されました66。

スペクトル登録は、クロマトグラフィーシステム、Ekspert MicroLC 200 Plus System (Eksigent、米国カリフォルニア州レッドウッドシティ) に接続された TripleTOF 5600+ (Sciex Framingham、米国マサチューセッツ州) 質量分析計で実行されました。すべてのクロマトグラフィー分離は、ChromXP C18CL カラム (3 µm、120 Å、150 × 0.3 mm) で実行されました。各サンプルについて、各 MS 実行のクロマトグラフィー勾配は 60 分間で 11 ～ 42.5% B (溶媒 A: 0% 水溶液、0.1% ギ酸、溶媒 B: 100% アセトニトリル、0.1% ギ酸) でした。システム全体は、SCIEX Analyst TF 1.7.1 ソフトウェアによって制御されました。スペクトルライブラリの測定値は、データ依存取得 (DDA) モードで取得されました。適用された DDA メソッドの各サイクルは、400 ～ 1200 m/z の範囲で 100 ms でプリカーサースペクトルを蓄積し、続いて 100 ～ 1800 m/z の範囲で 50 ms で上位 20 プリカーサーのプロダクトイオンスペクトルを蓄積することで構成され、結果として合計サイクル時間は 1.15 秒です。以前にフラグメント化された前駆体イオンは動的に除外されました。

PeaksStudio XPRO ソフトウェア (Bioinfor、カナダ) をデータベース検索に使用しました。タンパク質の同定は、レビュー済みの Annelida データベース (2022 年 4 月 5 日、Uniprot) に基づいて次のパラメーターを使用して実行されました: フィルター電荷 2 ～ 8、前駆体質量の誤差許容度 - 25 ppm、フラグメントイオン許容度 0.5、ペプチドごとの最大切断ミス - 3固定修飾 - カルバミドメチル化、可変 - Met 酸化、ペプチドおよびタンパク質の 1% FDR。最終分析は Spider ファイルの結果に基づいて実行されました。取得されたデータは、識別子の下で Pride リポジトリ 67 に保管されました。

SPR実験のために、3 mMモルのスフィンゴミエリン(SM)および1-パルミトイル-2-デオイルphpスファチジルコリン(POPC)リポソームストック溶液を調製した。リポソーム溶液は前述のように調製されました68。簡単に説明すると、POPC (Avanti Polar Lipids、米国) およびスフィンゴミエリン (鶏卵、Avanti Polar Lipids、米国) の凍結乾燥粉末を PBS 緩衝液 (Sigma Aldrich、米国) に懸濁しました。リン脂質懸濁液を、加熱 (333 K) しながら超音波槽で 30 分間インキュベートし、277 K で 30 分間インキュベートするという 10 回のインキュベーションサイクルにさらしました。次に、Avanti Mini Extruder (Avanti Polar Lipids、米国) を使用して押出を実行しました。 0.1μmの細孔膜を採用。この手順、すなわち脂質溶液を押出機に通す操作を１１回繰り返した。押出手順の完了後、サンプルは使用できる状態になりました。

スフィンゴミエリン (SM) および 1-パルミトイル-2-デオイルphpスファチジルコリン (POPC) 脂質の結合は、Biacore T200 装置 (Cytiva、米国) を使用して L1 センサー (Cytiva、米国) 上で実行されました。メーカーのマニュアルに記載されているように、L1 センサーチップの表面に脂質 (SM または POPC) を固定化した後、タンパク質の相互作用を分析しました。 SM は 3659.96 RU (± 415.45 RU) の応答レベルまで固定化され、POPC は 4995.67 RU (± 570.47 RU) の応答レベルまで固定化されました。次に、0.5 mg/mL アルブミン溶液でセンサーをブロックした後、標準的なメーカーのプロトコール「注入と回収」を使用しました。タンパク質抽出物は、タンパク質の結合を可能にする固定脂質を備えたセンサーチップの表面上に流されました。次に、0.5% TFA で 30 秒インキュベートした後、結合タンパク質を 50 mM NH4HCO3 50 μl で回収しました。次に、少なくとも 2 つのフローセルから回収されたサンプルを MS で分析しました。すべての分析後、バックグラウンドの参照応答スペクトルが実験応答スペクトルから差し引かれ、結果がセンサーグラムに表示されました。

試験した脂質に結合したタンパク質を含む SPR 実験から収集した画分を、溶液中で古典的な消化に供しました。トリプシンを添加する前に、サンプルを 50 mM DTT 溶液 (45 分間、56 °C) で処理し、続いて IAA (暗所で 45 分間) で処理しました。トリプシン消化は 37 °C で一晩実行されました。溶液のｐＨを下げることによって消化を停止させたとき（水中１％ギ酸）、サンプルをＳｔａｇｅＴｉｐｓによって精製し、３０ｍｌに濃縮した。 LC-MS/MS 分析とタンパク質の同定は、Venetin-1 サンプルの場合と同様に実行されました。

タンパク質濃度 1 mg/mL の Venetin-1 溶液を超音波チャンバー (Pol-Sonic、ポーランド) に 40 °C で 10 分間入れました。次いで、水性懸濁液を、パンチングカーボンフィルムを備えたＴＥＭメッシュ（ＱｕａｎｔｉｆｏｉｌＲ２／２；ＱｕａｎｔｉｆｏｉｌＭｉｃｒｏＴｏｏｌｓＧｍｂＨ、グロースレービハウ、ドイツ）上でガラス化した。メッシュは、Femto デバイス (Diener Electronic、エブハウゼン、ドイツ) を使用して、酸素プラズマ中で 15 秒間事前に活性化されました。 3 µL のサンプルをメッシュに適用しました。その後、濾紙でのブロッティングと、Vitrobot Mark IV ブロワー (FEI Company、ヒルズボロ、オレゴン州、米国) を使用した液体エタン中での瞬間凍結を実行しました。ガラス張りのサンプルは、Cryo-TEM Gatan 626 ホルダー (Gatan Inc.、プレザントン、米国) に配置するまで液体窒素中に保管されました。極低温透過電子顕微鏡 (cryo-TEM) 画像は、加速電圧 200 kV で動作する電界放射型砲 (FEG) を備えた Tecnai F20 X TWIN 顕微鏡 (FEI Company、オレゴン州ヒルズボロ、米国) を使用して取得しました。 Eagle 4 k HS カメラ (FEI 社、米国) を画像記録に使用し、TIA ソフトウェア (FEI 社、米国) を処理に使用しました。

Venetin-1 の化学研究は、XPS 電子分光法を使用して行われました。分析は、Prevac UHV マルチチャンバー分析システム (Prevac、ポーランド) で実行されました。モリブデン支持体に取り付けた後、試験した Venetin 1 サンプルを室温で UHV システムローディングロック内で約 5 × 10-8 mbar の一定の高真空になるまで脱気しました。 XPS 分析は、サンプルが UHV システムの分析チャンバーに導入された後に実行されました。単色のAlKα線源が光電子励起源として機能した。光電子は、アルミニウム陽極を備えた VG Scienta SAX 100 ランプと VG Scienta XM 780 モノクロメーターによって生成された、特性線 AlKα およびエネルギー 1486.7 eV の X 線放射によって励起されました。

調査スペクトルは、次の分析装置パラメータを使用して、広範囲の結合エネルギーで実行されました: 動作モード - スイープ、遷移エネルギー 200 eV、光電子結合エネルギーの測定範囲 0 ～ 1200 eV、測定ステップ 0.5 eV、単一の収集時間ステップ - 0.2 秒、反復数 - 4。

調査スペクトルの実行後、炭素、酸素、窒素、リン、硫黄についても、狭い範囲の結合エネルギーのスペクトルが作成されました。テストは次の分析装置パラメータで実行されました: 動作モード - スイープ、50 eV 遷移エネルギー、測定ステップ - 0.1 eV、単一ステップでの収集時間 - 0.667 秒。

定量的計算のために、得られたスペクトルを Casa XPS ソフトウェアで処理しました。結合エネルギーに対応する X 軸は、C1s 脂肪族炭素ピークを使用して校正されました。このピークに対応する結合エネルギーは EB = 285.0 eV と仮定されました。

Venetin-1 微粒子のサイズを特徴付けるために、Prometheus Panta (NanoTemper Technologies GmbH、ドイツ) 装置を使用して DLS 実験を実行しました。サンプルは、レプリカとして機能する 8 つのキャピラリーにロードされ、並行分析により微粒子の均質性が明らかになりました。

プロテオーム解析から得られたデータは PRIDE リポジトリに保管されており、アクセッション番号 PXD034132 で入手できます。

Bade, BC & Dela, CCS 肺がん 2020: 疫学、病因、予防。クリン。胸部医学。 41. https://doi.org/10.1016/j.ccm.2019.10.001 (2020)。

論文 PubMed Google Scholar

Herbst, R.、Morgensztern, D. & Boshoff, C. 非小細胞肺がんの生物学と管理。ネイチャー 553、446–454 (2018)。

論文 ADS CAS PubMed Google Scholar

ヘクト、SS 喫煙と肺がん: 化学的メカニズムと予防へのアプローチ。ランセット・オンコル。 8、461–469 (2002)。

記事 Google Scholar

Akopyan, G. & Bonavida, B. タバコ煙の発癌物質 NNK と肺腫瘍形成の理解 (総説)。内部。Ｊ．オンコル． 29、745–752 (2006)。

CAS PubMed Google Scholar

バータ、JA、パウエル、カリフォルニア、ウィズニベスキー、JP 肺がんの世界的疫学。アン。グロブ。健康 https://doi.org/10.5334/aogh.2419 (2019)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Raaschou-Nielsen, O. et al. 17 の欧州コホートにおける大気汚染と肺がんの発生率: 大気汚染影響に関する欧州コホート研究 (ESCAPE) からの前向き分析。ランセット・オンコル。 14、813–822 (2013)。

論文 PubMed Google Scholar

サン、Ｓ．ら。非小細胞肺がん患者におけるERCC1、RRM1、TUBB3およびTYMS遺伝子のmRNA発現の予後的重要性。経験値それで。医学。 10、937–941 (2015)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gridelli, C. et al. 非小細胞肺がん。ナット。 Rev.Dis. プライマー 21、15009。https://doi.org/10.1038/nrdp.2015.9 (2015)。

記事 Google Scholar

Travis, WD 肺神経内分泌腫瘍の進歩。アン。オンコル。 21、65–71 (2010)。

記事 Google Scholar

マゲシュ、V. et al. Ocimum sanctum は、A549 肺癌細胞のアポトーシスを誘導し、ルイス肺癌細胞の in vivo での増殖を抑制します。フィトテル。解像度 23、1385–1391 (2009)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Lee、SH、Jaganath、IB、Wang、SM & Sekaran、SD ヒト肺 (A549) および乳癌 (MCF-7) 癌細胞株に対するフィランサスの抗転移効果。 PLoS ONE 6、e20994。 https://doi.org/10.1371/journal.pone.0020994 (2011)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ramalakshmi, P.、Subramanian, N.、Saravanan, R.、Mohanakrishnan, H. & Muthu, M. ヒト肺がん細胞株に対するコレウスアンビオニカス (Karpooravalli) の抗がん効果 (A549)。内部。 J.Dev. 4、2442–2449 (2014)。

Google スカラー

Wei-Sheng, C. et al. ボストリシンは、PI3K/Akt 経路の下方制御を介してヒト肺癌 A549 細胞の増殖を阻害します。 J.Exp. クリン。がん研究所 https://doi.org/10.1186/1756-9966-30-17 (2011)。

記事 Google Scholar

シャオ、CJら。真菌由来の薬剤であるピクニジオンは、A549 ヒト肺がん細胞の細胞周期停止とアポトーシスを誘導します。化学。バイオル。交流する。 197、23–30 (2012)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ウォン、KLら。漢方薬から単離された生理活性タンパク質およびペプチドであり、医薬品としての可能性を秘めています。顎。医学。 https://doi.org/10.1186/1749-8546-9-19 (2014)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Arulvasu, C. et al. A549 および HCT 15 癌細胞株に対するイワシ油エマルジョンの抗増殖効果の評価。内部。Ｊ．ＰｈａｒｍｔｅｃｈＲｅｓ． 2、1171–1177 (2010)。

CAS Google スカラー

Hua、Z.、Wang、YH、Cao、HW、Pu、LJ & Cui、YD ミミズ Eisenia foetida の体腔液からのタンパク質の精製とその溶血、抗菌、抗腫瘍活性の評価。薬局。バイオル。 49、269–275 (2011)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Vasanthi, K.、会長、K. & Ranjit Singh、AJA ミミズ (Eudrilus eugeniae) ペーストの抗菌活性。アフリカＪ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．科学。テクノロジー。 7、789–793 (2013)。

記事 Google Scholar

Verma, YK および Verma, MK ミミズ - 安定で強力な抗菌化合物の潜在的な供給源 - 分離と精製の研究。内部。Ｊ．Ｐｈａｒｍ．薬局。科学。 4、540–543 (2012)。

Google スカラー

Bhorgin, AJ & Uma, K. ミミズ粉末 (Lampito mauritii) の抗菌活性。内部。 J.Cur. 微生物。アプリ。科学。 3、437–443 (2014)。

Google スカラー

セトゥラクシュミ、KC、ラニラクシュミ、KC、トーマス、AP ミミズ Eudrilus eugeniae ペーストと体腔液の抗菌性と抗真菌性の可能性。 AJOB 5、1–7 (2018)。

Google スカラー

Ansari, AA & Sitaram, K. アイセニア・フェティダから得られたミミズ粉末の抗菌性および抗真菌性の研究。午前。Ｊ．フードテクノロジー． 6、329–335 (2011)。

記事 Google Scholar

Mathur、A. et al. ミミズ抽出物の抗菌活性。化学。薬局。解像度 2、364–370 (2010)。

Google スカラー

Rajesh, C.、Rajamanikkam, K.、Nadana, G.、Vadivu, R. & Palanichelvam, K. ミミズ Eudrilus eugeniae の体腔液は、in vitro で真菌の菌糸の成長を阻害します。 IJEAT 9、792–796 (2019)。

記事 Google Scholar

Arslan-Aydoğdu、EO および Çotuk、A. さまざまな地域に生息する Dendrabaena veneta (Oligochaeta、Lumbricidae) の体腔液の抗菌および溶血活性。ＩＵＦＳＪ．Ｂｉｏｌ． 67、23–32 (2008)。

Google スカラー

Chauhan、PS、Tomar、J.、Prasad、GBKS、Agrawal、OP Eudrilus eugeniae のミミズ組織抽出物の抗菌活性の評価。Ｊ．Ｃｈｅｍ．薬局。解像度 6、28–38 (2014)。

Google スカラー

フィオルカ、MJ 他 Dendrabaena veneta の体腔液のタンパク質-炭水化物画分によって誘発されるカンジダアルビカンス細胞の代謝、構造、プロテオーム変化。科学。議員 11、16711。https://doi.org/10.1038/s41598-021-96093-1 (2021)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

フィオルカ、MJ 他 Dendrabaena veneta の体腔液からのタンパク質-炭水化物画分の作用標的としてのカンジダアルビカンスの細胞壁。科学。議員 10、16352。https://doi.org/10.1038/s41598-020-73044-w (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

フィオルカ、MJ 他 A549 ヒト肺癌細胞に対するミミズ Dendrabaena veneta の体腔液の抗腫瘍活性とアポトーシス作用。 APMIS 127、435–448 (2019)。

論文 PubMed Google Scholar

フィオルカ、MJ 他ミミズ Dendrabaena veneta から得られた体腔液画分の抗カンジダアルビカンス効果。 PLoS ONE 14、e0212869。 https://doi.org/10.1371/journal.pone.0212869 (2019)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

鯉沼正史ほか X線光電子分光法と電気化学容量による還元酸化グラフェンの分析。化学。レット。 42、924–926 (2013)。

記事 CAS Google Scholar

ラブチンスキー、MK et al. 酸化グラフェンからアミノ化グラフェンへ: 容易な合成、その構造および電子特性。科学。議員 10、6902。https://doi.org/10.1038/s41598-020-63935-3 (2020)。

記事 ADS CAS Google Scholar

ラダエリ、G.ら。 pH 調整された水分散過フッ素化アクリル共重合体による非常に効果的な付着防止コーティング: 加硫ゴムの場合。上級メーター。インターフェース。 https://doi.org/10.1002/admi.201600069 (2016)。

記事 Google Scholar

Raicopol, M.、Andronescu, C.、Atasiei, R.、Hanganu, A. & Pilan, L. 導電性ポリマーの重合後の電気化学的機能化: ポリピロール電極でのジアゾニウム塩電解還元。Ｊ．Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍ．社会 161、103–113 (2014)。

記事 Google Scholar

Larciprete, R.、Gardonio, S.、Petaccia, L. & Lizzit, S. 二層 C ナノチューブの原子状酸素官能基化。カーボン 47、2579–2589 (2009)。

記事 CAS Google Scholar

Wagstaff、M. et al. アナターゼ TiO2(101) 表面へのホスホン酸の吸着に関する実験的研究。Ｊ．Ｐｈｙｓ．化学。 120、1693–1700 (2016)。

CAS Google スカラー

クーパー、エル他。ミミズは喜ぶ：古くて安価で議論の余地のないモデルは、神経免疫系に重点を置いた統合医療へのアプローチを明確にするのに役立つかもしれない。エヴィド。ベースの補完。代替品。医学。 2012、164152。https://doi.org/10.1155/2012/164152 (2012)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

リー、YCら。 PI3K/Aktシグナル伝達経路の下方制御を介したヒト非小細胞肺癌A549細胞における遊走および浸潤に対するアンドログラフォリドの阻害効果。ユーロ。Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． 632、23–32 (2010)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

モラ、ML 他。ヒト肺癌 H460 細胞に対する Bulnesia sarmienti の抗癌活性とアポトーシス効果。オンコル。解像度 18、259–267 (2009)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Harikumar, KB、Kuttan, G. & Kuttan, R. Phyllanthus amarus は、カスパーゼ 3 の活性化と Bcl-2 の下方制御を通じて、細胞増殖を阻害し、ダルトンリンパ腫腹水細胞のアポトーシスを誘導します。統合します。がんサー。 8、190–194 (2009)。

論文 PubMed Google Scholar

ヤン、HLら。 Hseu 樟芝による MCF-7 乳がん細胞の増殖阻害とアポトーシスの誘導。キャンサーレット。 231、215–227 (2006)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Glinsky, GV, Glinsky, VV, Ivanova, AB & Hueser, CJ アポトーシスと転移: 転移性癌細胞のアポトーシス耐性の増加は、アポトーシス実行機構の重大な欠損と関連しています。キャンサーレット。 115、185–193 (1997)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Berger, T.、Mak, TW & McIlwain, DR カスパーゼは細胞死と疾患において機能します。コールドスプリングハーブ。視点。バイオル。 5、a008656。 https://doi.org/10.1101/cshperspect.a008656 (2013)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dawar、S.、Dorstyn、L.、Kumar、S. & Shalini、S. カスパーゼの古い機能、新しい機能、および新たな機能。細胞死は異なります。 22、526–539 (2015)。

論文 PubMed Google Scholar

Lamkanfi、M. & Van Opdenbosch、N. 細胞死、炎症、疾患におけるカスパーゼ。免疫 50、1352 ～ 1364 年。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Freel, CD、Kornbluth, S. & Parrish, AB カスパーゼの活性化と機能を制御する細胞機構。コールドスプリングハーブ。視点。バイオル。 5、a008672。 https://doi.org/10.1101/cshperspect.a008672 (2013)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ramirez, MLG & Salvesen, GS カスパーゼ機構に関する入門書。セミン。細胞。開発者バイオル。 82、79–85 (2018)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Green, DR & Llambi, F. 細胞死シグナル伝達。コールドスプリングハーブ。視点。バイオル。 https://doi.org/10.1101/cshperspect.a006080 (2015)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Nikolaev, NI、Müller, T.、Williams, DJ & Liu, Y. 原子間力顕微鏡で測定した、細胞死の進行に伴うヒト間葉系幹細胞の硬さの変化。Ｊ．Ｂｉｏｍｅｃｈ． 47、625–630 (2014)。

論文 PubMed Google Scholar

小林洋、太田直、梅田正。ミミズ Eisenia foetida の体腔液に含まれるタンパク質、リセニンの生物学。内部。Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ． 236、45–99 (2004)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

清川英ほかリセニンおよびリセニン関連タンパク質によるスフィンゴミエリンの認識。生化学 43、9766–9773 (2004)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Kulma, M. & Anderluh, G. 細孔形成を超えて: 細孔形成タンパク質によって誘導される細胞膜の再構成。細胞。モル。生命科学。 78、6229–6249 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Sukumwang, N. & 梅沢, K. ミミズ由来の孔形成毒素リセニンとその阻害剤のスクリーニング。 Toxins 5、1392–1401 (2013)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

特許番号 234801 カンジダアルビカンスによって引き起こされる真菌症の治療のための、寄生虫デンドロバエナベネタからの体腔液の高分子量画分 (2020)。

特許番号 237653。肺がんの治療に使用するミミズ Dendrabaena veneta の体腔液のタンパク質-炭水化物画分 (2021)。

特許番号 236228。結腸癌の治療に使用するためにミミズ Dendrabaena veneta の体腔液から単離された高分子量タンパク質-炭水化物画分 (2021)。

チェルウォンカ、A. et al. ミミズ Dendrabaena veneta の体腔液から単離されたタンパク質-炭水化物画分のヒト結腸腺癌細胞に対するアポトーシス促進作用。バイオメッド。薬剤師。 126、110035。https://doi.org/10.1016/j.biopha.2020.110035 (2020)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

特許 P.429033。非特異的免疫療法で使用するためにデンドロバエナ・ベネタ体腔液から単離されたタンパク質-糖画分 (2021)。 (特許出願中)。

Fiołka, M.J.、Zagaja, M.P.、Piersiak, T.D.、Wróbel, M. & Pawelec, J. Dendrabaena veneta (環形動物: Oligochaeta) の腸内細菌は抗マイコバクテリア活性を持っています。Ｊ．インバーテブラ．パソル。 105、63–73 (2010)。

論文 PubMed Google Scholar

フィオルカ、MJ 他ミミズ Dendrabaena veneta から単離された腸内細菌 Raoultella ornithinolytica の代謝産物から精製された糖タンパク質複合体の抗カンジダアルビカンス作用。Ｊ．Ａｐｐｌ．微生物。 113、1106–1119 (2012)。

論文 PubMed Google Scholar

フィオルカ、MJ 他ミミズ Dendrabaena veneta から単離された腸内細菌 Raoultella ornithinolytica からの多糖類 - タンパク質複合体の抗真菌効果と抗癌効果。病原菌。ディス。 69、49–61 (2013)。

Google スカラー

フィオルカ、MJ 他 Raoultella ornithinolytica 細胞外代謝産物の単離後に得られる新規 Tris-ペプチド複合体の抗腫瘍効果とアポトーシス効果。Ｊ．Ａｐｐｌ．微生物。 118、1357–1369 (2015)。

論文 PubMed Google Scholar

フィオルカ、MJ 他 Raoultella ornithinolytica の細胞外代謝産物から得られた新しい糖脂質-ペプチド複合体の抗マイコバクテリア作用。 APMIS 123、1069–1080 (2015)。

論文 PubMed Google Scholar

Bradford, MM タンパク質と色素の結合原理を利用した、マイクログラム量のタンパク質を定量するための迅速かつ高感度な方法。アナル。生化学。 72、248–254 (1976)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Wiśniewski, JR フィルター支援サンプル前処理 (FASP) および多酵素消化 FASP プロトコルの定量的評価。アナル。化学。 88、5438–5443 (2016)。

論文 PubMed Google Scholar

Rappsilber, J.、Mann, M.、Ishihama, Y. StageTips を使用したプロテオミクスのためのペプチドの微量精製、濃縮、前分別および保存のためのプロトコル。ナット。プロトック。 2、1896 ～ 1906 年 (2007)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

2019 年の PRIDE データベースと関連ツールとリソース: 定量化データのサポートの改善 Nucleic Acids Research Oxford Academic (アクセス日 2021.04.30)。 https://academic.oup.com/nar/article/47/D1/D442/5160986 (2019)。

Jurczak、P. et al. ヒトシスタチン C オリゴマー化の潜在的な界面としての DMPC リン脂質二重層: NMR 分光法を使用したタンパク質-リポソーム相互作用の分析。膜 11、13。https://doi.org/10.3390/membrane11010013 (2021)。

記事 CAS Google Scholar

リファレンスをダウンロードする

活性化合物の化学分析は、ポーランド国立科学センターのプロジェクト [2020/37/B/NZ7/00763] によって支援されました。 BEAS-2B細胞を提供していただいたマリア・スクウォドフスカ・キュリー記念がんセンターおよび腫瘍学研究所（ポーランド、グリヴィツェ）のドロタ・シチェグリンスカ博士に感謝いたします。

ポーランド、グダニスクのグダニスク大学およびグダニスク医科大学の生命工学部

マグダ・リビッカ、パウリナ・チャプレフスカ、カタルジナ・ヴェングシン、アガタ・シュピヒ、ナタリア・ムシアウ

ルブリン医科大学、生物学および遺伝学科、ルブリン、ポーランド

ヨランタ・ジモフスカ

マリア・キュリー・スクウォドフスカ大学、ルブリン、ポーランド、化学学部、分析研究所

ウェロニカ・ソフィンスカ＝シュミエル

ポーランド、ルブリンのマリア・キュリー・スクウォドフスカ大学生物科学研究所免疫生物学部

シルヴィア・ヴォイチク＝ミェシェフスカ & マルタ・J・フィオルカ

ポーランド、ルブリンのマリア・キュリー・スクウォドフスカ大学生物科学研究所細胞生物学部

キンガ・ルータク

グダニスク大学化学学部、グダニスク、ポーランド

プシェミスワフ・ユルチャク

マロポルスカバイオテクノロジーセンター、ヤギェウォ大学、クラクフ、ポーランド

ヤクブ・ノワク

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

MF は Venetin-1 の活性複合体を取得し、Cryo-TEM および SEM 分析、AFM 調製、アポトーシス分析 (図 5) を行って研究を調整し、主要な原稿テキストを執筆しました。 SWM は序文を書き、図 7、4 と統計分析を作成しました。 JRは癌細胞のカスパーゼ分析と光学顕微鏡検査を行った（図55a）。 KL は図 4、図 6、および文献を作成しました。 MR はフローサイトメトリー分析を行いました。結果のPC分析、SPR測定の準備、原稿の準備; KW は SPR 測定と SPR データの編集を行いました。 PJはリポソームの調製を行った。 AS と NM は SageElf 分離、FASP 消化、LC-MS/MS メソッドの準備と分析、WSC は XPS 分析、JN は Pantha 分析を作成しました。

Paulina Czaplewska または Marta J. Fiołka への通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガーネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

オープンアクセスこの記事はクリエイティブコモンズ表示 4.0 国際ライセンスに基づいてライセンスされており、元の著者と情報源に適切なクレジットを表示する限り、あらゆる媒体または形式での使用、共有、翻案、配布、複製が許可されます。クリエイティブコモンズライセンスへのリンクを提供し、変更が加えられたかどうかを示します。この記事内の画像またはその他のサードパーティ素材は、素材のクレジットラインに別段の記載がない限り、記事のクリエイティブコモンズライセンスに含まれています。素材が記事のクリエイティブコモンズライセンスに含まれておらず、意図した使用が法的規制で許可されていない場合、または許可されている使用を超えている場合は、著作権所有者から直接許可を得る必要があります。このライセンスのコピーを表示するには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ にアクセスしてください。

転載と許可

Rybicka、M.、Czaplewska、P.、Rzymowska、J. 他。ミミズの体腔液由来の新規ベネチン-1 ナノ粒子は、非小細胞肺がんの治療薬として有望です。 Sci Rep 12、18497 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-21665-8

引用をダウンロード

受信日: 2022 年 5 月 17 日

受理日: 2022 年 9 月 29 日

公開日: 2022 年 11 月 2 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-21665-8

次のリンクを共有すると、誰でもこのコンテンツを読むことができます。

申し訳ございませんが、現在この記事の共有リンクは利用できません。

Springer Nature SharedIt コンテンツ共有イニシアチブによって提供

科学レポート (2023)

コメントを送信すると、利用規約とコミュニティガイドラインに従うことに同意したことになります。虐待的なもの、または当社の規約やガイドラインに準拠していないものを見つけた場合は、不適切としてフラグを立ててください。

ニュース