AAVのトランスクリプトーム解析

Scientific Reports volume 12、記事番号: 19395 (2022) この記事を引用

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5 オルトメトリック

メトリクスの詳細

網膜症は複雑な病態を伴う多因子疾患であり、最終的には視力喪失につながります。 動物モデルは、病態生理の理解と新しい治療選択肢の特定を容易にします。 しかし、各動物モデルは特定の疾患の側面のみを反映しており、ほとんどの疾患モデルにおける特定の分子変化の理解は限られています。 ここでは、ヒト VEGF-A、TNF-α、または IL-6 のいずれかを発現する組換えアデノ随伴ウイルス (AAV) を形質導入したマウス眼組織のトランスクリプトーム解析を実施しました。 VEGF 発現は、細胞外マトリックス (ECM) 関連遺伝子の明確な制御をもたらしました。 対照的に、TNF-αとIL-6の両方は、インターロイキンシグナル伝達および補体カスケードにおいてより同等の遺伝子発現変化を引き起こし、TNF-α誘導性の変化はより顕著でした。 さらに、単一細胞の RNA シーケンス データの統合は、VEGF による内皮細胞特異的マーカー遺伝子の増加を示唆し、一方、TNF-α 発現は T 細胞マーカーの発現を増加させました。 TNF-α と IL-6 の両方の発現により、マクロファージ マーカーが増加しました。 最後に、AAV-VEGF 処置マウスにおけるトランスクリプトーム変化は、特に ECM 成分および内皮細胞特異的遺伝子発現に関して、酸素誘発性網膜症モデルで観察された遺伝子発現変化とほぼ一致しました。 まとめると、我々の研究は、VEGF、TNF-α、およびIL-6によって誘発される遺伝子発現変化の貴重な研究を表しており、研究者がヒトの病態生理学との一致に基づいて網膜症の適切な動物モデルを選択するのに役立ちます。

糖尿病性網膜症（DR）、加齢黄斑変性症（AMD）、ぶどう膜炎、未熟児網膜症（ROP）などの網膜症は、血管障害、炎症、神経変性、線維症などの複雑な病態を患者に示し、最終的には失明につながります。 これらの網膜の病状には、血管内皮増殖因子 (VEGF)、腫瘍壊死因子α (TNF-α)、またはインターロイキン-6 (IL-6) の発現の変化など、多くの分子変化が関連しています。 VEGF は血管漏出と病的血管新生を引き起こし、VEGF タンパク質は湿性 AMD1、DR2、糖尿病性黄斑浮腫 (DME)3、および ROP4 で上方制御されることが示されています。 したがって、抗VEGF治療が滲出性AMD5およびDME6の標準治療として浮上しました。 多くの網膜症のもう 1 つの共通の特徴は炎症です。DR7、8 およびぶどう膜炎患者 9、10 の硝子体では、TNF-α や IL-6 タンパク質などの炎症誘発性サイトカインが上方制御されています。

さまざまな前臨床げっ歯類モデルにより、網膜症における VEGF、TNF-α、または IL-6 の機能が直接的または間接的に解明されています。 滲出性 AMD や ROP などの増殖性網膜症で観察されるものと同様の血管病変を示す動物モデルの 1 つとして、酸素誘発網膜症 (OIR) モデルが頻繁に使用されます 11,12。 VEGF13、14、15 を発現するトランスジェニック マウス、組換え VEGF タンパク質 16、17、18 または VEGF19、20、21、22、23 を発現する組換えアデノ随伴ウイルス (AAV) の眼内注射は、VEGF が必要であるだけでなく、十分であることをさらに実証しました。血管障害を引き起こす。 したがって、抗VEGF治療はOIRモデルにおける血管新生を防止し 17,24 、これらの前臨床研究は現代の抗VEGF治療への道を切り開いた。 さらに、網膜症患者で観察される炎症過程は、例えばエンドトキシンまたは抗原誘発ブドウ膜炎などのブドウ膜炎マウスモデル 25,26,27 や Aire 遺伝子を欠くトランスジェニックマウスなど、げっ歯類でモデル化することもできます。 同様に、組換えタンパク質または AAV を介した TNF-α および IL-6 の発現は齧歯動物の眼に炎症を誘発しますが、IL-6 の直接的な機能についてはより議論の余地があります 19、30、31、32。 繰り返しますが、抗 TNF-α または抗 IL-6 治療は、さまざまなブドウ膜炎モデルで誘発された病態を改善します 33、34、35。

前臨床研究の文脈において、AAV を介した遺伝子導入は、新しい動物モデルを作成するための強力な方法として最近登場しました。 主な利点として、AAV は組織および細胞型に特異的な方法で導入遺伝子の長期発現を可能にします。 以前に、我々は、AAV を介した発現が、IVT 注射後 1、3、および 6 週間でヒト導入遺伝子の定常的かつ長期的な発現をもたらすことを示しました 19。 さらに、マウスの眼におけるヒト VEGF、TNF-α、および IL-6 の AAV 媒介発現が、経路特異的なヒト関連の網膜病理を引き起こすことを実証しました。 簡単に言うと、AAV による VEGF の発現は、血管漏出と血管新生を誘導しました。 一方、炎症誘発性サイトカインである TNF-α と IL-6 は両方とも免疫細胞を活性化しました。 TNF-αはさらに、血管炎、線維症、線維性網膜上膜の発生を引き起こします。

近年、次世代配列決定技術により、網膜症における分子変化の詳細な研究が可能になり、AMD および DR 患者における疾患の進行についてのより良い理解がもたらされました 36,37,38。 同様に、網膜症の複数のげっ歯類モデルのトランスクリプトームが配列決定され、分析されています 39,40,41,42。 OIR モデルについては、いくつかの研究で、低酸素症、血管新生、炎症に関連する時点依存的な遺伝子発現変化が特定されています 43、44、45、46、47。 ただし、網膜症の他のマウスモデルとの比較はまだ行われていません。 さらに、最新の単一細胞 RNA シーケンス (scRNA-Seq) アプローチにより、健康な哺乳動物の眼組織と病気の哺乳動物の眼組織の細胞組織について前例のない洞察が得られました 48,49,50,51,52,53,54。 より詳細には、Heng et al. 自然発生的なブドウ膜網膜炎モデルである Aire-/- マウスの単一細胞配列決定によって、非常に多様な免疫細胞集団が Aire-/- マウスの網膜に侵入し、Th1 細胞がこのモデルの主要なエフェクター T 細胞を表すことが実証され、このような単一細胞配列決定アプローチには大きな可能性があります。 網膜症に関して利用可能なバルクおよび単一細胞データセットの数が増加するにつれて、さまざまな網膜症モデルからのデータを統合し、それらを分子レベルで比較できる可能性も高まります。

この研究では、マウスにヒト VEGF、TNF-α、または IL-6 を発現する硝子体内注射された組換え AAV のトランスクリプトーム解析を提供します。 我々は、AAV を介したヒト導入遺伝子の発現により、異なるトランスクリプトーム応答が導入されることを観察しました。TNF-α と IL6 は重複する遺伝子発現変化を示しましたが、VEGF の過剰発現は、TNF-α や IL-6 と比較して、より明確な応答を引き起こしました。 さらに詳しく、各実験条件によって影響を受ける経路を調査すると、VEGFは細胞外マトリックス（ECM）関連遺伝子の特異的な制御を引き起こし、一方、TNF-αおよびIL-6はインターロイキンシグナル伝達の変化を誘導した。 さらに、Madcam1 などの細胞接着分子を含む TNF-α に関連する特定の遺伝子発現変化を同定し、ヒト網膜内皮細胞における TNF-α による MAdCAM-1 の保存された制御をさらに実証しました。 単一細胞の RNA シーケンス データを統合することにより、TNF-α 発現後の T 細胞特異的遺伝子の増加を示すことができ、実際、TNF-α 媒介 T 細胞浸潤が免疫蛍光によって検証されました。 さまざまなトランスジェニックマウスモデルにおけるトランスクリプトーム変化の評価に加えて、確立された OIR モデルにおけるトランスクリプトーム変化の詳細な時間経過を生成しました。 AAV過剰発現モデルとOIRマウスのトランスクリプトーム変化を比較すると、OIRモデルではAAV-VEGF処置眼と後期反応(P16)との間で最大の重複が観察され、これにはECM経路および内皮細胞特異的マーカー遺伝子の変化が最も顕著に含まれていた。 顕著な遺伝子制御における OIR 特異的変化には、AAV-VEGF 導入遺伝子発現後には観察されなかった神経シグナル伝達経路が含まれていました。 結論として、私たちの研究は、各動物モデルが異なる遺伝子発現プロファイルを生成し、さまざまな研究課題の要件に応じてモデルを慎重に選択する必要があることを示唆しています。

ヒトVEGF、TNF-α、およびIL-6を発現する眼組織のトランスクリプトームプロファイルを調査および比較するために、3つのヒト導入遺伝子の1つを発現するAAVをマウスの目に硝子体内注射しました（図1a）。 対照として、一致する濃度でAAVスタッファーを注射した眼と注射していない眼を使用しました。 AAV-VEGF はより低いウイルス用量 (1 × 108 VG/眼) で注射されたのに対し、AAV-TNF-α および AAV-IL-6 は 1 × 109 VG/眼で注射されたことに注意してください。 すべての動物の眼は、予想される病理を検証し、表現型の重症度を評価するために、組織解剖およびRNA配列決定の直前に生体内で画像化されました。 以前に発表された研究19と一致して、青色自家蛍光（BAF）イメージング（補足図1）、眼底フルオレセイン血管造影（FFA、補足図2）、および光学検査に基づくと、AAVスタッファー注射は両方の濃度で明らかな網膜病理を誘発しませんでした。コヒーレンス断層撮影法（OCT、補足図3）。BAF画像には、原因不明の少数の不規則で明るいまたは暗い領域を除きます。 FFA画像に見られるように、6サンプル中3サンプルにAAV-VEGFを注射すると、血管構造の拡大および異常な成長と血管漏出が引き起こされました（補足図2）。 AAV-TNF-αを注射した目は、OCTスキャンに示されているように、硝子体に細胞浸潤を示しました（補足図3）。 最後に、AAV-IL-6を注射した目は、BAFイメージングで網膜下の過蛍光焦点を示しました（補足図1）。

AAV を介したヒト VEGF、TNF-α、または IL-6 の発現は、明確なトランスクリプトーム変化を引き起こします。 (a) 実験デザイン: 6 つの治療グループ (非注射、AAV スタッファー低、AAV スタッファー高、AAV-VEGF、AAV-TNF-α、および AAV-IL-6) からの RNA シーケンスのための網膜およびアイカップ組織IVT および in vivo イメージングの 3 週間後に収集されました。 画像は BioRender を使用して生成されました。 (b) 網膜とアイカップ組織の両方における各治療グループにおけるヒト導入遺伝子VEGF、TNF-α、およびIL-6の特異的発現(CPM: Counts Per Million)。 (c) RNAscope 技術を使用した in situ ハイブリダイゼーションにより、毛様体 (上のパネル) および網膜中心の内層 (下のパネル) における 3 つのヒト導入遺伝子 (ピンクの矢印) の発現が実証されました。 AAV-VEGF処理した眼の毛様体周囲の異常な内皮細胞(黒い矢印)とAAV-TNF-α処理した眼の浸潤免疫細胞(黒い矢印)に注目してください。 （ d ）PCAは、組織間の大きな違い（上のパネル）と、各組織内でそれぞれVEGF、TNF-α、およびIL-6によって誘発される特定の変化（下のパネル）を実証しました。 低用量 = 1 × 108 VG/眼; 高線量 = 1 × 109 VG/眼。 2 つの最初の主成分によって説明される分散のパーセンテージが、それぞれの x ラベルと y ラベルとともに表示されます。

6 つの治療グループすべてから、網膜色素上皮 (RPE)、脈絡膜、強膜、毛様体を含む網膜および後部アイカップから総 RNA が抽出されました。 RNA 完全性数 (RIN) が低いために除外された 2 つのサンプルとは別に、グループあたり 6 つの生物学的複製の配列が決定されました。 シーケンシング ライブラリは平均 3,130 万リードの深さでシーケンスされ、80.1% が mRNA 転写物にマッピングされ、リボソーム含量が低い (2.1%) ことから、RNA シーケンス データの全体的な品質が良好であることが示唆されます。 予想通り、ヒト導入遺伝子はそれぞれの治療グループで強い発現を示しました（図1b）。 この研究で使用されたShH10キャプシドは主にミュラーグリア55に感染すると記載されていますが、網膜とアイカップの両方で導入遺伝子の同等の発現レベルに気づきました。VEGF導入遺伝子については、qRT-PCRによって確認しました（補足図4a）。 ShH10 キャプシドによって形質導入された主要な細胞タイプを同定するために、AAV-VEGF、AAV-TNF-α、および AAV-IL-6 を注射したマウスの目の組織学的断面で RNAscope テクノロジーを使用して in situ ハイブリダイゼーションを実行しました (図.1c）。 文献 55 と一致して、導入遺伝子の強力かつ特異的な発現は網膜の内部 (おそらく網膜神経節細胞とミュラーグリア) に限定されていました。 AAVスタッファーコントロールで処理した眼ではmRNA染色が観察されなかったため（補足図4b）、3つのそれぞれの導入遺伝子を検出するために使用したプローブは特異的であると結論付けました。 アイカップ内では、RPE または脈絡膜組織ではヒト導入遺伝子の発現は観察されませんでしたが、毛様体では強い発現が認められ、アイカップサンプルで RNA-Seq によって測定された遺伝子発現が毛様体に由来することが示されました。 (図1c)。

主成分分析（PCA）は、網膜サンプルとアイカップサンプルの間の遺伝子発現の最大の差異を示しました（図1d、左パネル）。 網膜組織内では、主要な 3 つの治療グループと AAV スタッファー コントロールまたは非注射コントロールの両方の間でサンプルがさらに分離していることが観察されました (図 1d、中央および右パネル)。 PCA では、3 つの対照グループすべてのサンプルが非常に近くに出現し、AAV 自体の IVT 注射によって引き起こされる遺伝子発現に大きな変化がないことが示唆されました。 さらに、AAV-TNF-α および AAV-IL-6 サンプルは一緒にグループ化され、網膜およびアイカップ組織の両方で対照サンプルから良好に分離されていました。 しかし、AAV-TNF-α サンプルは、AAV-IL-6 と比較して、コントロールからの全体的な分離がより強力であることを示しました。 AAV-VEGFの場合、AAV-VEGF網膜サンプルのうち4つが対照サンプルおよびAAV-TNF-α/AAV-IL-6サンプルと明らかに異なることがわかりました（図1d）。 ただし、AAV-VEGF処理マウスの残りの2つの網膜サンプル（複製2 + 3）は、最初の2つの主成分内で対照からの分離を示さなかった（補足図4c、d）。 これらの所見と一致して、FFAに基づいて複製2 + 3は両方とも正常であるように見え（補足図2;補足図4c）、ウイルスの形質導入が表現型を引き起こすには不十分であった可能性があることを示唆しています。 両方のサンプルでヒトVEGFの発現の減少がさらに観察されたため（補足図4c）、その後のすべての分析からこれら2つのサンプルを削除しました。

次に、3 つの治療グループ AAV-VEGF、TNF-α、および AAV-IL-6 における差次的発現 (DE) 遺伝子をそれぞれの AAV スタッファー コントロールと比較し、また AAV スタッファーを非注射と比較して調査しました。コントロール（補足表S1）。 予想通り、網膜とアイカップの両方について、AAVスタッファーを注入したサンプルと注入していないサンプルの間で有意な遺伝子発現の変化はわずかしか見つかりませんでした（BH調整後のp値<0.05、図2a）。これは、コントロールAAVの影響が限定的であることを再度示唆しています。遺伝子発現に対する注射。 我々は、TNF-αおよびIL-6をトランスフェクトしたアイカップ組織において最大数の有意な発現変化を観察したが、AAV-VEGFは主に網膜遺伝子発現に影響を与えたが、アイカップ組織には影響を与えなかった。 各治療群において、それぞれのヒト導入遺伝子は、対応する治療群内で差次的に上方制御される遺伝子の上位に含まれており、網膜とアイカップの両方での強力なAAV媒介発現が実証されました（図2b）。 AAV-TNF-α を注射した眼では、Vcam1 や Madcam1 などの細胞接着分子、および Ccl2 などのケモカインが最も強力に調節解除された遺伝子の 1 つであり、内皮細胞への免疫細胞接着の調節における TNF-α のよく知られた機能を裏付けています 56。 RNA配列決定の結果を確認するために、Ccl2発現をqRT-PCRによって検証しました。これは、AAV-TNF-α処理した眼で見られるCcl2の最も高い発現と同様の発現パターンを示しました（補足図4e、f）。 注目すべきことに、内因性VEGFはAAV-VEGF処置眼において下方制御され、内因性TNF-αはAAVを介したTNF-αまたはIL-6の発現により上方制御された（補足図5）。

差次的遺伝子発現解析により、VEGF と比較して、TNF-α および IL-6 で治療された眼における関連する変化が明らかになりました。 (a) それぞれの対照と比較した、各処理における差次的に発現された遺伝子の数 (BH 調整 p 値 < 0.05)。 （ b ）AAV-VEGF、AAV-TNF-α、またはAAV-IL-6の注射時に網膜およびアイカップ組織で最も異なって調節される遺伝子を示す火山プロット。 (c) 治療群間で重複する差次的に発現される遺伝子のセットを表すベン図。 820 個の遺伝子が AAV-VEGF によって特異的に制御されました。 網膜とアイカップ組織の両方において、TNF-αとIL-6によって誘導されて差次的に制御される遺伝子の間には大きな重複がある。 (d) スピアマン相関により、網膜とアイカップ組織の両方における TNF-α と IL-6 誘導性の遺伝子発現変化との間の強い相関関係が検証されました。 樹状図は階層的なクラスタリングを示しており、したがって、それぞれの対照と比較した治療の類似性により倍率変化が誘発されました。

網膜疾患の共通の制御因子を見つけるだけでなく、発現した 3 つの導入遺伝子によって誘導される特定の表現型に相関する可能性のある特定の経路を同定するために、AAV-VEGF、AAV-TNF-α、および AAV-IL-6 のトランスクリプトーム シグネチャーを比較しました (図2c)。 全体として、網膜組織では、3 つの AAV 治療グループすべてで 44 個の遺伝子のみが有意に異なって制御されました。 820 DE 遺伝子は AAV-VEGF 処理網膜に特異的であり、AAV-TNF-α および AAV-IL-6 と比較して AAV-VEGF における異なる転写応答をさらに強調しています。 AAV-VEGF処理したアイカップ組織では2つの遺伝子のみが有意に差次的に調節されており、提示されたAAV駆動モデルにおいてVEGFが主に網膜細胞に影響を与えることを示唆している。 AAV-TNF-αおよびAAV-IL-6形質導入網膜では、それぞれ1282個および272個の遺伝子がDEであり、これら2つのグループ間で133個の遺伝子が重複していた。 さらに、AAV-IL-6 によって特異的に制御される遺伝子は 68 個のみでしたが、網膜では TNF-α によって 966 個が制御されており、AAV-IL-6 によって誘導される遺伝子発現変化の大部分が AAV-TNF-α に含まれていることを示唆しています。応答。 これらの結果と一致して、網膜およびアイカップ組織の両方においてAAV-TNF-α処理発現プロファイルとAAV-IL-6処理発現プロファイルとの間で倍率変化の最も高い相関が観察されたが、AAV-VEGFはより明確に見えた（図2d）。

次に、AAV-VEGF、AAV-TNF-α、またはAAV-IL-6処理によって顕著な影響を受けたREACTOME経路を分析しました（超幾何検定、BH調整p値<0.01）。 3 つの治療グループすべての網膜で濃縮された経路は 1 つだけ (図 3a)、すなわち「血管壁での細胞表面相互作用」 (図 3b) でした。 AAV-VEGFを注入した網膜では、最も制御されていない経路は「細胞外マトリックス組織」でしたが、AAV-TNF-αとAAV-IL-6は両方とも「リンパ球と細胞間の免疫調節相互作用」経路で最も強い遺伝子発現変化を誘導しました。非リンパ系細胞」。 網膜のVEGF特異的経路のうち、「ECMプロテオグリカン」およびコラーゲン関連経路は大幅に調節解除されていた。 TNF-αを注入した網膜組織では、合計29の経路、たとえば「クラスA1ロドプシン様受容体」経路が特異的に制御されていた。 AAV-IL-6 サンプルでは、​​「補体の初期誘発」と「C4 および C2 活性化因子の生成」という 2 つの経路が特に豊富でした。 TNF-α と IL6 の両方によって調節される経路には、「インターロイキンによるシグナル伝達」および「補体カスケード」経路が含まれます。

AAV-VEGF治療はECM関連遺伝子を変化させたが、AAV-TNF-αおよびAAV-IL-6は網膜組織に強い炎症反応を誘導した。 (a) 網膜では 33 の経路が VEGF によって特異的に制御され、IL-6 によって制御される経路の大部分は、網膜とアイカップ組織の両方において TNF-α によっても制御されました。 (b) すべての REACTOME 経路は、少なくとも 1 つの処理 (AAV-VEGF、AAV-TNF-α、および AAV-IL-6) で有意に濃縮されました (BH 調整 p 値 < 0.01)。

AAV-VEGF形質導入アイカップ組織では非常に少数の遺伝子のみが有意に差次的に調節されたため、アイカップ組織ではAAV-TNF-αおよびAAV-IL-6処理のみを比較しました（補足図6）。 もう一度言いますが、差次的遺伝子発現分析と同様に、AAV-IL-6眼で同定された経路の大部分は、網膜とアイカップ組織の両方でAAV-TNF-αと共有されました（補足図6b）。

補体カスケード経路は、AMD5 を含むさまざまな網膜症の疾患進行に潜在的に関与しています。 したがって、この経路における遺伝子発現の変化をより詳細に分析しました。 両方の組織の3つの治療グループすべてを比較すると、REACTOME経路「補体カスケード」に関連するDE遺伝子の絶対数が最も多く、AAV-TNF-αで治療した目のアイカップ組織で観察されました（図4a）。 興味深いことに、補体活性化因子 C3、Cfp、および Cfb は AAV-TNF-α で強く上方制御されましたが、Cfh または Cfi などの補体阻害因子は AAV-TNF-α では制御されませんでした。 対照的に、AAV-IL-6によって調節される補体関連遺伝子は少なく、補体阻害剤Cfiの強力な上方制御が含まれており、AAV-TNF-αと比較して補体経路の活性化がないか、またはより穏やかであることを示しています。 全体として、これらの結果は、AAV-TNF-αで治療した眼における補体経路の活性化を示唆しています。 AAV-TNF-αを注射した眼で最大の上方制御を示す遺伝子の1つは、網膜とアイカップ組織の両方のC3でした（図4b）。 結果を検証するために、独立したマウスコホートでELISAによってC3発現を測定し57、AAV-TNF-α処理の6週間後にC3タンパク質の上方制御も検証しました（図4c）。 さらに、メカニズムの証拠として、TNF-α中和抗体ゴリムマブはTNF-αを介したC3の上方制御を有意に減少させ（図4c）、C3の上方制御がTNF-αに依存しており、我々のモデルでは逆転する可能性があることを示しています。 。

ＴＮＦ－αは、補体経路の強力な上方制御を誘導した（ａ）補体カスケード経路のいくつかのメンバーの上方制御は、特にＡＡＶ－ＴＮＦ－α形質導入アイカップ組織において観察された。 左側の列の色付きの四角は、BH 調整済み P 値 < 0.05 での遺伝子発現の有意な変化を示します。 (b) C3 発現は、AAV-TNF-α 処理網膜およびアイカップで高度に上方制御されました。 （ c ）C3タンパク質は、AAV-TNF-α治療後6週間の独立したマウスコホートにおいてAAV-TNF-αによっても上方制御され、この上方制御はゴリムマブによる抗TNF-α治療によって部分的に回復されました（**p < 0.01） ; *p < 0.05、Tukey事後検定による一元配置分散分析; n = 3–6) ELISAで測定。

インテグリン細胞表面相互作用は、網膜における AAV-VEGF および AAV-TNF-α 治療群で有意に変化する数少ない経路の 1 つであるため、これら 2 つの条件間でどの遺伝子発現サインが共通であるか、または異なるかに興味がありました。 インテグリン細胞表面相互作用経路内で、AAV-VEGF と AAV-TNF-α の両方で同様に上方制御された遺伝子、AAV-VEGF 特異的に上方制御された遺伝子、AAV-TNF-α 特異的に下方制御された遺伝子、および制御された遺伝子の 4 つの異なるクラスターが観察されました。 AAV-TNF-αとAAV-IL-6の両方に存在します（図5a）。 網膜では、いくつかのコラーゲンがAAV-VEGF処理された眼で特異的に上方制御され、一方、AAV-TNF-αおよびAAV-IL-6は両方ともインテグリンサブユニットをコードする遺伝子の発現を誘導した。 興味深いことに、Icam1、Vcam1、Madcam1などの細胞接着分子（CAM）は、AAV-TNF-αを注射した眼でのみ高度に上方制御されました（図5a、b）。 Madcam1 は以前から TNF-α と関連付けられており、炎症性腸疾患の発症に重要な役割を果たしていますが、Vcam1 のような他の接着分子とは対照的に、網膜症の文脈で Madcam1 を説明している研究はほとんどありません。 したがって、MAdCAM-1 がヒト網膜症にも関連しているかどうかをテストするために、我々は初代ヒト網膜微小血管内皮細胞 (HRMEC) を組換えヒト TNF-α で刺激しました。 注目すべきことに、TNF-α刺激はHRMECにおけるMadcam1発現を強く増加させた（図5c）。これは、MAdCAM-1がヒト網膜でも重要な役割を果たし、さまざまなヒト網膜症の疾患進行に寄与している可能性があることを示唆している。

Madcam-1 を含む細胞接着分子は、AAV-TNF-α で治療された眼において特異的に上方制御されます。 (a) REACTOME 経路「インテグリン細胞表面相互作用」内の特定の遺伝子発現パターンにより、AAV-VEGF によるコラーゲン遺伝子の上方制御が明らかになりました。 左の列も、BH 調整 P 値 < 0.05 で有意な遺伝子発現変化を示しています。 インテグリンファミリーのメンバーは主に AAV-TNF-α および AAV-IL-6 処理の影響を受けましたが、AAV-VEGF は影響を受けませんでした。 (b) Madcam1 は、網膜とアイカップ組織の両方において、AAV-TNF-α を注射された眼において最も上方制御された遺伝子の 1 つでした。 （ c ）ヒト MADCAM1 発現は、ヒト網膜微小血管内皮細胞の TNF-α 刺激によって上方制御されます（HRMEC、 ** p < 0.01、対応のない t 検定、 n = 3）。

バルク RNA-Seq データは細胞特異的レベルでの遺伝子発現を解決しないため、AAV によって誘発される細胞型特異的変化を特定するために、最近発表されたヒト網膜および RPE の単一細胞 RNA-Seq 研究 48,49,54 を利用しました。 -VEGF、AAV-TNF-α、およびAAV-IL-6。 この目的のために、網膜とRPE組織の両方のscRNA-Seqデータセットでさまざまな細胞型の細胞特異的マーカー遺伝子を同定し、これらをAAV誘発網膜症モデルで差次的に発現する遺伝子と比較しました。 Heng 単一細胞 RNA-Seq データの場合、我々は、AAV-TNF- と同様に、健康な網膜だけでなく炎症を起こした網膜にも存在するすべての細胞タイプを最もよく反映するために、野生型マウスとぶどう膜炎様 Aire-/- 網膜のサンプルを組み合わせました。 αおよびAAV-IL-6で処理された眼。 AAV-VEGF治療した眼で観察された血管障害と一致して、AAV-VEGF治療後の内皮および血管周囲細胞特異的マーカー遺伝子の有意な濃縮（超幾何検定、BH調整p値<0.05）が観察されました（図6a） 、左パネル）。 対照的に、単球/マクロファージ特異的遺伝子は、AAV-TNF-αおよびAAV-IL-6で処理した網膜およびアイカップ組織の両方からのDE遺伝子と有意に重複した(図6a)。 興味深いことに、これらの免疫細胞の濃縮は、AAV-IL-6 を注射した眼と比較して、AAV-TNF-α を注射した眼の方が強く、これは前述の AAV-TNF-α によって誘発されるより重篤な炎症と一致しています 19。 ヒト網膜および RPE 組織から得た 2 番目に利用可能な scRNA-Seq データセット 49 を用いたフォローアップ分析により、AAV-TNF-α および AAV-IL-6 由来 DE 遺伝子におけるマクロファージ/ミクログリア特異的マーカーの有意な濃縮、および内皮間の重複が検証されました。 AAV-VEGF処理された眼で同定された細胞型特異的マーカーおよびDE遺伝子（補足図7a）。

内皮細胞特異的マーカー遺伝子は VEGF によって上方制御され、T 細胞特異的遺伝子は TNF-α によって上方制御されます。 (a) VEGF 発現は、網膜組織における内皮細胞および血管周囲細胞に特異的なマーカー遺伝子の上方制御を誘導しました。 TNF-α と IL-6 の発現は両方とも、マクロファージ/単球特異的遺伝子の濃縮を誘導しました。 TNF-αのみが、網膜におけるB細胞およびT細胞特異的遺伝子の有意な上方制御を誘導しました。 (b) いずれの治療においても有意に調節解除されたT細胞特異的遺伝子のヒートマップは、AAV-TNF-αによるこれらの遺伝子の強力な上方制御を実証した。 （c）汎T細胞マーカーCD3による免疫蛍光染色により、AAV-TNF-αを注射した眼におけるT細胞浸潤が明らかになりました（緑=CD3、青=DAPI）。 AAV-TNF-αで治療した眼では、網膜の厚さが増加し、網膜層が組織化されていないことに注目してください。

同定された関連する細胞型特異的マーカー遺伝子（血管内皮細胞、単球）の発現変化はほとんどが陽性であり（補足図7b、c）、それぞれのAAV処理によるこれらの細胞型の一般的な増加が示唆されています。 我々の濃縮分析により、TNF-α網膜におけるT細胞特異的マーカー遺伝子の最も強い上方制御がさらに示されました（図6a、b）。 我々は、網膜断面の組織学的分析によってこの観察を追跡調査し、汎T細胞マーカーCD3を発現する細胞がAAV-TNF-αを注射された眼に存在することを実際に検証した（図6c）。浸潤はAAV-TNF-αによって誘導されます。

増殖性網膜症によく使用される動物モデルは、血管新生と神経変性の両方を示す酸素誘発網膜症 (OIR) モデルです。 新生マウスは生後 7 日目から 12 日目まで 75% の酸素に曝露され、その後 17 日目まで室内空気 (21% 酸素) に戻ります。 7 日目では、マウスの子の網膜血管系はまだ未熟で、高酸素条件に脆弱です。 網膜の中心にある毛細血管が失われると、無血管領域が形成されます。 12日目に室温に戻すと、その領域は低酸素状態になり、Hif1α依存性のVEGF発現が血管新生を誘発し、P1711,12でピークとなることが示されている。 このモデルでは、低酸素状態により、無血管領域でニューロンのアポトーシスと網膜の薄化も観察されます 58。 AAV-VEGF、TNF-α、およびIL-6によって誘発されるトランスクリプトームの変化をより深く理解するために、AAV形質導入網膜のトランスクリプトームをOIR網膜と比較することを目的としました。 まず、生後 12 日 (P12)、P13、P14、P15、および P16 の時点で、OIR モデルで誘発されたトランスクリプトーム変化を対照と比較して調べました。 PCA は、OIR モデルとコントロールの間の明確な分離を実証しました (図 7a)。 注目すべきことに、コントロールマウスおよびOIRマウスのトランスクリプトームの時間依存性変化もPCAではっきりと確認できました（図7a）。 最大数の有意に差次的に発現された遺伝子（BH調整p値<0.05）は、マウスを高酸素チャンバーから取り出した直後のP12（10,855）で検出されました（補足表S2）。 後の時点では、差次的に発現された遺伝子の数は、P13とP16の間で約3000〜7000遺伝子に減少し（図7b）、高酸素治療の終了直後（P12）の一過性応答を示唆しています。 予想どおり、以前の研究と同様に、無血管領域での低酸素症の発症時のP13から始まり、Hif1a依存性因子マウスVegfの内因性発現が時間とともに徐々に増加しました（補足図8a）。 Il6発現は検出されなかったが、TNF-α発現はP13および14でピークに達し(補足図8b)、OIRモデルにおける初期炎症成分を示唆している。

AAV-VEGF 処理のトランスクリプトーム サインは、P16 OIR マウスで観察されたものと最も類似しています。 (a) PCA は、治療 (正常酸素状態と低酸素状態) および時点に応じてサンプルを明確に分離することを示しました。 （ b ）最大数の遺伝子発現変化はP12およびP13で観察され、示差的に調節される遺伝子の数はP14〜P16で3000〜5000遺伝子で安定しました。 (c) OIR P16 と AAV-VEGF の間で、同様の遺伝子発現パターンの最も強い濃縮が観察されました (2.2 倍の濃縮)。 （ d ）AAV-VEGF、AAV-TNF-α、AAV-IL6のDE遺伝子とOIRモデル（P16）の間の重複がベン図に示されています。 （ e ）内皮細胞によって特異的に発現される遺伝子は、AAV-VEGFを注射した眼およびP15 / P16 OIR網膜では上方制御されましたが、P12 / P13 OIR網膜では上方制御されませんでした。

3つのAAVマウスモデルとOIRマウスモデルを比較すると、AAV-VEGFモデルで同定された遺伝子と比較して、OIR網膜で差次的に発現される遺伝子の有意な重複（超幾何検定、BH調整p値<0.01）が観察されました（図7c、 d)。 DE 遺伝子の最大の濃縮は、AAV-VEGF マウスと OIR モデルの間で、OIR モデルにおける血管表現型のピーク時間である P16 で見られました。 以前に説明した単一細胞データセット48、54の統合により、とりわけ、血管細胞特異的マーカー遺伝子もAAV-VEGFデータと同様にOIRデータセット（補足図8c）に富んでいることが実証されました。 注目すべきことに、内皮細胞特異的遺伝子の大部分は、AAV-VEGFと同様に、初期のOIR時点で最初に下方制御され、その後P15から上方制御され始めた(図7e)。 対照的に、後期OIRマウスモデルから同定されたDE遺伝子は、双極性細胞で特異的に発現される遺伝子と有意に重複していたが、AAV-VEGFから同定されたものではなかった。 私たちは、血管周囲および血管内皮細胞タイプがAAV-VEGF治療の影響を受けており（図6a）、このモデルで誘発された栄養失調と虚血によりOIRモデルでは追加の細胞タイプが影響を受けると結論付けました。

最後に、OIRモデルと比較して、AAV-VEGF駆動網膜症モデルでどの経路が影響を受けたかを理解することを目的としました（補足図8d）。 興味深いことに、細胞外マトリックスに関連する複数の経路は、AAV-VEGF モデルまたは OIR モデルのいずれかから同定された DE 遺伝子に富んでいて、両方のモデルで同様の変化があったことを示唆しています。 再び、「細胞外マトリックス組織」は、AAV-VEGF だけでなく OIR P16 の両方において最も強力な調節解除された経路の 1 つとして現れました。 興味深いことに、OIR 特異的経路ではニューロンシグナル伝達関連遺伝子が豊富でしたが、AAV-VEGF 特異的経路には細胞表面相互作用に関与する経路が含まれていました。 全体として、私たちの分析では、網膜症の 4 つの異なるマウス モデル間の類似点だけでなく相違点も明らかになったため、研究者にとって前臨床研究のテーマに関して最も適切な動物モデルを特定するための貴重なリソースとなります。

この研究では、AAV-VEGF、AAV-TNF-α、および AAV-IL-6 によって誘発されるトランスクリプトーム変化を測定し、これらの発現変化を相互に比較し、また十分に確立された OIR モデルで観察された遺伝子発現変化と比較しました。 私たちの目的は、網膜の病状に寄与する潜在的な分子機構をさらに理解することであり、また、各病状に適切な動物モデルを選択する能力を高めることでもありました。

AAV は、タイミングと組織特異的な発現に関して高度な柔軟性を可能にする新しい動物モデルを迅速に生成するための有用なツールとして登場しました。 私たちの研究では、3 つのヒト導入遺伝子の発現のために ShH10 キャプシドを選択しました。 RNA-Seq などのハイスループットな方法で測定した地球規模でさえ、生物学的に不活性な配列を持つコントロール カプシド (1 × 108 または 1 × 109 VG/眼) をマウスの眼に注入しても、遺伝子発現はほとんど発生しませんでした。変化します。 AAV を介した hTNF-α、hIL-6、または hVEGF の発現は、これらのヒト導入遺伝子の高度な発現をもたらし、その結果、強力で明確なトランスクリプトーム変化が生じました。 AAV 発現導入遺伝子のヒトバージョンとマウスバージョンが同時に存在することによって引き起こされる RNA-Seq の測定誤差は理論的には可能ですが、ヒト導入遺伝子はコドンが最適化されており、V5 タグを持っているため、大きな誤定量化はないと予想されます。それらの内因性転写配列とは十分に異なっています。 さらに、AAV 発現トランスジーンの存在下では、独自にマッピングされたリードのパーセンテージの減少は観察されませんでした (データは示されていません)。

現在の文献によると、ShH10 は主にミュラー グリア 55 に感染し、ミュラー グリア 55 は解剖学的に突起とともに網膜全体に広がり、それによって網膜全体での VEGF、TNF-α、および IL-6 の分泌を可能にします。 RNAscope 分析により、RGC 層および内核層内で、ミュラー グリアに由来する可能性のあるヒト導入遺伝子の発現が示されました。 さらに、RNAscope分析では、毛様体における3つの導入遺伝子すべての強力な発現がさらに実証され、毛様体を含む解剖されたアイカップ組織のRNA-Seq分析で導入遺伝子の高い発現レベルが検出された理由が説明されました。 毛様体におけるヒト導入遺伝子の強い発現も、AAV-VEGF を注射した眼における網膜周辺領域の毛様体周囲の内皮組織の成長を説明する可能性があります 19。 興味深いことに、ShH10 キャプシドについて説明した元の論文では、ShH10-GFP の IVT 注射により、毛様体だけでなくミュラー グリアでも強力な GFP 発現が引き起こされましたが、この発見はそれ以上議論されませんでした 55。 一方、他の研究者は、緑内障の治療のために毛様体への形質導入効率が良好なAAVキャプシドを研究し、AAV1、AAV2、AA5、およびAAV6キャプシドと比較して、ShH10キャプシドが毛様体への形質導入に最も適していることを発見した60。 毛様体の形質導入は特定の用途では望ましい場合がありますが、細胞内タンパク質を送達する遺伝子治療アプローチなどでは、厳密に細胞型特異的な発現が必要になる場合があります。 VEGF、TNF-α、IL-6 などの分泌因子の場合、細胞型特異的な発現は必要ない場合があります。 しかし、将来的には、網膜で VEGF、TNF-α、および IL-6 を発現する他のキャプシドをテストし、異なる細胞指向性によって達成される表現型を比較す​​ることは依然として興味深いでしょう。 したがって、アプリケーションごとにカプシドを慎重に選択する必要があると結論付けています。

我々の分析では、AAV-TNF-αを注射した眼では、補体カスケードに存在する大きく変化する遺伝子が強く特異的に上方制御されていました。 それらの中で、補体経路因子 C3 は、AAV-TNF-α を注射された眼において最も強く上方制御される遺伝子の 1 つでした。 C3 は古典的および代替補体経路の活性化において中心的な役割を果たしており、C3 および補体カスケードの他のメンバーにおける変異は、AMD61、62、63 およびぶどう膜炎のリスクの上昇と相関しています64。 さらに、C3はAMD患者の網膜で上方制御されていることが知られており65、66、ブドウ膜炎患者の硝子体、水層および血清でも67、68、69、したがって補体系を標的とすることは網膜症を治療するための魅力的なアプローチとなる70。 したがって、抗 C3 および抗 C5 治療は現在、AMD に続発する地理的萎縮 (GA) に対する後期臨床試験で評価されています 71,72。 過去には、補体遺伝子の発現を改変するトランスジェニック動物、または補体関連遺伝子のヒト変異体を発現するマウスが、疾患進行への寄与を理解するのに極めて有用であることが証明されている65,73,74,75,76,77,78。 新規かつ効果的な治療法をさらに開発するには、補体経路を強力に活性化する動物モデルが必要です。 LPS 誘発ぶどう膜炎モデルでは、C3 を含む補体関連遺伝子が上方制御されており 39 、補体活性化が示唆されています。 同様に、実験的自己免疫性ブドウ膜炎 (EAU) は補体系の活性化をもたらし、補体系の遮断により疾患の病態が改善されます 79。 補体系の活性化はレーザー誘発脈絡膜血管新生（CNV）モデルでも見られ、さまざまな補体因子の阻害には有益な効果がありました80、81、82。 ただし、実験的ぶどう膜炎モデルとレーザー CNV モデルはどちらも一時的なものであり、短期間の調査のみが可能です。 対照的に、提示された AAV-TNF-α モデルでは、C3 は AAV-TNF-α の IVT 注射後 3 週間および 6 週間で強力かつ持続的な上方制御を示し、補体系の長期研究が可能になりました。 さらに、メカニズムの証明として、中和 TNF-α 抗体ゴリムマブによる治療により C3 発現が減少することを示し、このモデルでは補体活性化が可逆的であることが実証されました。 要約すると、AAV-TNF-α 誘発マウス モデルは、数十年にわたって発症するヒトの病態に匹敵する長期 TNF-α および C3 発現を特徴とし、疾患進行における補体系の役割を研究するための貴重なツールを提供します。 。

C3 に加えて、Icam1、Vcam1、Madcam1 などの細胞接着分子 (CAM) も AAV-TNF-α を注射した眼で高度に上方制御され、AAV-TNF-α を注射した眼における免疫細胞浸潤と血管炎の以前の観察を強化しました。組織学19. MAdCAM-1 は、さまざまな内皮細胞において TNF-α によって誘導され、T 細胞を炎症組織に動員します 83、84、85。したがって、最近、炎症性腸疾患を治療するための興味深い標的として同定されています 86。 Madcam1 の上方制御に加えて、ぶどう膜炎患者およびぶどう膜炎げっ歯類モデルにおける T 細胞のよく説明されている役割と一致して、AAV-TNF-α 駆動ぶどう膜炎様モデルで T 細胞浸潤が観察されました 87,88。 網膜症における TNF-α と CAM の役割には一般的な関心が寄せられていますが、我々の知る限り、Peng らによる最近の研究は 1 件だけ存在します。 網膜変性におけるマウスMadcam1の直接的な機能を実証している83。 Peng らと同様に、本発明者らは、AAV-TNF-α を注射した眼における Madcam1 の上方制御が T 細胞の浸潤と相関することを実証した。 この観察を拡張して、我々はMAdCAM-1がTNF-α刺激されたHRMECでも上方制御されることを実証し、TNF-αによって誘導されるMAdCAM-1の制御がヒト網膜細胞にも関連している可能性があることを示唆した。

さまざまな網膜症疾患モデル間の違いをよりよく理解するために、生成された AAV 駆動網膜症モデルの遺伝子発現プロファイルを、頻繁に使用される OIR モデルの RNASeq データと比較しました 11,12。 OIR モデルに存在する一過性の発現ダイナミクスを捕捉するために、高酸素処理後の 5 つの時点でマウスの目を収集しました。 実際、他の著者も OIR 遺伝子発現の解析を行っていますが、多くの研究は、ここで紹介するトランスクリプトーム解析全体とは対照的に、トランスクリプトームの一部のみを評価するマイクロアレイ データに依存しています。 一方、OIR RNA-Seq 研究では、時間依存性の遺伝子発現変化についてのより詳細な洞察が得られる、私たちの研究と比較して、より密度の低い時点のサンプリングが含まれていました。 Yangらの研究46は、高酸素治療中およびその直後の遺伝子発現変化に焦点を当てていたが、我々の研究は主に、正常酸素状態に戻った後の遺伝子発現変化と、AAV誘発性遺伝子発現変化との詳細な比較に興味を持っていた。 それにもかかわらず、我々は、2 つの研究間で重要な遺伝子の共通の遺伝子発現サインを観察しました。たとえば、VEGF と Edn2 遺伝子は両方とも P13 で上方制御されていました。

VEGF が OIR モデルの主要な推進力であり、抗 VEGF 治療が OIR モデルにおける血管新生を防止することはよく知られています 17,24。 したがって、予想通り、AAV-VEGF モデルの DE 遺伝子は、OIR モデルで同定されたものと最も大きな重複を示しました。 単一細胞の RNA-Seq 発現データを統合することにより、OIR モデルで測定された時間経過内で、内皮細胞特異的遺伝子が最初に下方制御され、次に P15 から上方制御されることが示されました。 また、他の研究では、OIR モデルにおける CD34 などの血管新生関連遺伝子が P12 で下方制御される一方、Esm1 や Edn2 などの内皮細胞特異的遺伝子が P1789 で上方制御されることが判明しました。 Esm1 は、血管新生に重要な役割を持つ先端細胞の VEGF によって誘導されるよく知られた遺伝子であり、その阻害により、OIR、レーザー CNV、rho/VEGF トランスジェニック マウスなどのさまざまなげっ歯類の血管新生モデルの血管新生が阻害されます 90,91。 したがって、OIR データセットと AAV-VEGF 駆動モデルの両方で Esm1 遺伝子の上方制御も観察され、観察された血管新生表現型と非常によく似ていました。 OIR モデルでは遺伝子発現変化の高い時間分解能が得られるため、P14 に対する内皮細胞特異的遺伝子の下方制御と上方制御の間のスイッチを正確に特定することができました。 これらの遺伝子発現変化は、P12 で血管系の発達が損なわれ、無血管領域が存在し、その後、P1792,93 付近で血管新生がピークとなる OIR モデルに存在する表現型の変化と非常によく一致します。

ECM関連経路や内皮細胞特異的反応を含む多くの経路は、OIRモデルとAAV-VEGF処置マウス間で類似していましたが、これらの疾患モデル間の違いも観察されました。たとえば、OIRモデルでは、AAV-VEGFではそうではありませんでした。ニューロンシグナル伝達経路およびシナプス関連遺伝子では、DE 遺伝子が大幅に濃縮されました。 この観察と一致して、我々は、OIR モデルで同定された神経細胞特異的遺伝子 (双極細胞、RGC など) と DE 遺伝子の有意な重複を観察しました。 OIR モデルには、マウスの網膜で血管および神経ネットワークがまだ発達している時点に対応する、年齢 P12 から P17 の子犬が使用されます 94,95。 さらに、OIR モデルではニューロン死と網膜機能の低下が観察されており、おそらく低酸素によって引き起こされる虚血と栄養失調が原因と考えられます。 したがって、OIR モデルは、ヒトの早産児が罹患する疾患である未熟児網膜症 (ROP)93 のより適切なモデルとして議論されています。 OIR モデルには非常に若いマウスの子が必要ですが、将来的には、AMD や DR などの加齢関連または糖尿病関連のヒト網膜症をより厳密に反映するために、老齢マウスまたは糖尿病マウスをヒト導入遺伝子の AAV 過剰発現と組み合わせる可能性があります。

最適な実験デザインを確保するための私たちの努力にもかかわらず、特定の制限が適用されます。最も顕著なのは、AAV および OIR シーケンス データセットが独立した実験で生成されたことです。 さらに、生物学的な観点からも、成体マウスを使用して開発されたAAV誘発モデルとは対照的に、OIRモデルは発生中に非常に若いマウスの子マウスを使用するため、モデルは異なります。 OIR 研究では各時点で 3 つまたは 4 つのサンプルが含まれていましたが、AAV 研究は 1 グループあたり 5 つまたは 6 つの反復で実行されました。 さらに、ライブラリーの調製と配列決定は異なるプロトコルに依存していました。 これらの制限を軽減するために、我々の分析は絶対的な発現値ではなく、治療とそれぞれのコントロールの間の相対的な倍率変化に基づいており、それによってライブラリー調製における差異を考慮しています。

まとめると、ここでは、AAV-VEGF、TNF-α、または IL-6 駆動網膜症マウス モデルの遺伝子発現プロファイルを特徴付け、これらの測定値を公的に入手可能な単一細胞 RNA 発現データと組み合わせました。 私たちの研究は、網膜の病態を引き起こす分子および細胞特異的な変化について独自の洞察を与え、これにより網膜疾患の新たな潜在的な治療選択肢を明らかにすると同時に、ヒトの病態に匹敵する安定した疾患モデルでそれらを試験する手段を提供します。 十分に確立された OIR モデルにおける遺伝子発現の変化をさらに測定することで、網膜症の新規動物モデルと確立された動物モデルを比較し、特定の前臨床研究プロジェクトのニーズにどの動物モデルが最適であるかを決定するための重要な情報を研究者に提供しました。

C57BL/6 J マウスは Charles River (Sulzfeld, Germany) から購入しました。 AAV 研究には、生後 6 ～ 8 週の雄マウスを使用しました。 妊娠中の雌を OIR 研究用に購入し、P12 の雄と雌の子犬を OIR 実験に使用しました。 マウスは個別に換気されたケージ内で 2 ～ 5 匹のグループに分け、一定の温度と 12 時間の明暗サイクルで飼育されました。 マウスには標準的なげっ歯類の餌と水を自由に摂取させた。 動物実験は、ドイツの動物福祉法、欧州実験動物科学協会連合（FELASA）のガイドライン、ARRIVEガイドラインに従って実施され、バーデン州の動物福祉を担当する政府機関によって審査および承認されました。ヴュルテンベルク (Regierungspräsidium Tübingen、ドイツ)。

ユビキタスな CAG プロモーターを持つプラスミドは、遺伝子の 3' 末端に V5 タグ配列を持つ 3 つのヒト、コドン最適化導入遺伝子 (VEGF-A 165、TNF-α、および IL-6) をコードするように生成されました。 AAV スタッファー制御構築物には、UBE3A 遺伝子の 3' UTR の非コード配列が含まれており、これについては他の文献で説明されています (Strobel 2015)。 この研究で使用された AAV は、ShH10 キャプシドにパッケージ化されました (Klimczak 2009)。 AAV の産生と定量 PCR による定量は、以前に公開されたプロトコール (Strobel 2019) に従って行われました。 以下のヒト コドン最適化配列が各組換え AAV に含まれていました。

AAV-hIL6—。

AAV-hTNFa—。

AAV-hVEGF—。

イソフルラン麻酔下で、局所麻酔薬の点眼薬（Novesin、OmniVision）を適用した後、マウスにさまざまな AAV を硝子体内注射しました。 1 群あたり 6 匹のマウスの両眼に、1 µL AAV バッファー中の 1 × 108 ウイルスゲノム (VG)/眼 (低用量) または 1 × 109 VG/眼 (高用量) を注射しました。 AAV-VEGF は 1 × 108 VG/眼の濃度で注射され、AAV-TNF-α および AAV-IL-6 は 1 × 109 VG/眼で、対応する AAV スタッファーコントロールとともに注射されたことに注意してください。 独立したマウスコホートでは、AAV-TNF-α処理の2週間後に、目に1μLのビヒクルまたは中和抗TNF-αゴリムマブ（100mg/mL、Simponi、4,223,913、Komtur Apotheke）をIVT注射した。 IVT注射が失敗した場合(例えば、主要血管または水晶体の損傷により)、その眼は分析から除外された。

In vivo イメージングは​​以前に記載されているように行われました 19。 簡単に言うと、60〜90 mg/kgのケタミン（Medistar）および6〜8 mg/kgのキシラジン（Rompun、Bayer）を腹腔内注射することによってマウスを麻酔した。 瞳孔は、5 mg/mL トロピカミド (Mydrum、Bausch + Lomb) およびフェニレフリン (Neosynephrin-POS 10%、Ursapharm) で拡張されました。 55°広視野レンズを備えた Spectralis HRA/OCT デバイス (Heidelberg Engineering) を、光干渉断層撮影 (OCT) 画像および自動蛍光 (AF) 画像の記録に使用しました。 フルオレセイン眼底血管造影（FFA）では、200 μL の 0.2% フルオレセイン溶液（Alcon）を皮下注射し、Spectralis HRA/OCT（Heidelberg Engineering）を使用して注射の 90 秒後に記録しました。 マウスは頚椎脱臼により安楽死させた。 網膜とアイカップ（RPE、脈絡膜、強膜、毛様体を含む）を解剖し、液体窒素中で急速冷凍しました。

OIR 実験は、以前に公開されたプロトコル (Smith et al.11) に従って実行されました。 簡単に説明すると、生後 7 日の雄と雌の子犬を母親と一緒に高酸素室 (酸素 75%) に移しました。 Ｐ１２では、酸素濃度は約３時間以内にゆっくりと減少して正常酸素状態（酸素２１％）に戻った。 対照マウスは、実験全体にわたって正常酸素条件を維持した。 マウスは、P12、P13、P14、P15、およびP16で頚椎脱臼により安楽死させた。 解剖した網膜をRNAlater (Invitrogen)に保存した。

急速冷凍した解剖網膜およびアイカップ組織 (n = 72) を、Precellys Evolution ホモジナイザー (Bertin Technologies) を使用して 700 μL Qiazol (Qiagen) 中でホモジナイズしました。 網膜サンプルはセラミックビーズ (MPbio、6913-500) で均質化し、アイカップサンプルは金属ビーズ (Bertin Technologies、15,987,602) で均質化し、4 つの別々のバッチで処理しました。 オンカラム DNase 処理 (Qiagen、79,254) を含むメーカーの組織プロトコールに従って、miRNeasy Micro Kit (Qiagen、217,084) を使用して全 RNA を抽出しました。 総 RNA サンプル (アイカップ 36 個、網膜 36 個) は、蛍光ベースの Broad Range Quant-iT RNA アッセイ キット (Thermo Fisher Scientific) および標準感度 RNA 分析 DNF-471 キットを使用して、96 チャネル フラグメントで定量的および定性的に評価されました。それぞれアナライザー（Agilent）。 濃度は平均 48.7 ng/µL で、RIN は 5.2 ～ 9.6 の範囲で、中央値は 9.2 でした。 RIN が 6 未満の 2 つのサンプル、AAV-スタッファー (高) アイカップ複製 4 および AAV-VEGF アイカップ複製 5 は下流処理から除外されました。AAV 研究のすべてのサンプルの概要については、表 1 を参照してください。

生後 12 ～ 16 日の C57BL/6 J マウス (n = 32) から網膜を解剖しました。 RNAlater で保存した組織を破砕し、Precellys Evolution ホモジナイザー (Bertin Technologies) を使用して RLT バッファーを含む CK14 チューブ (VWR、10144-496) 内でホモジナイズしました。 次いで、最終溶出前のDNase消化を含むMagMAX-96全RNA単離キット(Thermo Fisher Scientific、AM1830)を使用して全RNAを抽出した(Qiagen、79254)。 全 RNA サンプルは、Gen5 Take3 モジュール (BioTek) を備えた Synergy マイクロプレート リーダーおよび 2100 Bioanalyzer システム (Agilent) 上の真核生物トータル RNA 6000 Nano マイクロ流体チップ (Agilent、5067-1511) でそれぞれ定量的および定性的に評価されました。 濃度は平均 136.3 ng/μL でしたが、選択されたサンプルの RIN は 8.4 以上でした。 すべてのサンプルはライブラリー調製のためにさらに処理されました。 OIR 研究のすべてのサンプルの概要については、表 2 を参照してください。

70 個の網膜およびアイカップ由来の RNA サンプルを MicroLab STAR 自動液体プラットフォーム (Hamilton) で正規化しました。 合計 250 ng の RNA インプットを、NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit for Illumina #E7760 と、NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module #E7490 アップストリームおよび NEBNext Multiplex Oligos for Illumina #E7600 を使用してライブラリー構築に使用しました。下流 (すべて New England Biolabs)。 メーカーのプロトコールからの唯一の逸脱は、二本鎖 cDNA 精製に推奨される SPRIselect ビーズの代わりに Ampure XP ビーズ (Beckman Coulter) を使用したことです。 インデックス PCR は 12 サイクルで実行され、最終ライブラリは 35 µL で溶出されました。 次に、mRNA ライブラリーを、Synergy HTX (BioTek) 上の高感度 dsDNA Quanti-iT アッセイ キット (ThermoFisher) によって定量しました。 ライブラリーのモル濃度は平均 149 nM でした。 また、mRNA ライブラリーのサイズ分布 (平均 360 bp のスミア分析) およびアダプターダイマーの存在 (< 0.5%) についても、96 チャンネル フラグメント アナライザー (Agilent) の高感度小フラグメント DNF-477 キットによって評価しました。 次に、70 個のシーケンシング ライブラリーすべてを MicroLab STAR (Hamilton) で正規化し、プールし、PhiX Control v3 (Illumina) でスパイクインしました。 その後、ライブラリープールを S4 フローセル上でクラスター化し、デュアルインデックス、2 × 100 bp 長のペアエンドリードを備えた NovaSeq 6000 シーケンシングシステム (Illumina) でシーケンスしました (リードパラメーター: Rd1: 101、Rd2: 8、Rd3: 8、Rd4: 101)、サンプルあたり平均深度 3,130 万パスフィルター読み取り (7.0% CV) に達しました。 RNA ライブラリーの調製と配列決定の説明は、Becker et al.36 の説明とほぼ一致しています。

メーカーの説明に従って、TruSeq Stranded mRNA LT キット - セット A (Illumina、RS-122-2101) と SuperScript II 逆転写酵素 (Thermo Fisher Scientific、18064014) を組み合わせたライブラリ構築には、100 ng の合計 RNA インプットを使用しました。プロトコル。 mRNA ライブラリーの品質は、DNA 1000 マイクロ流体チップ (Agilent、5067-1504) を使用してアダプターとヘテロダイマーの存在について評価され、ライブラリーのモル濃度は Quant-iT PicoGreen dsDNA アッセイ キット (Invitrogen、P11496) を使用して測定されました。 次に、32 個のシーケンシング ライブラリーすべてを正規化し、プールし、PhiX Control v3 (Illumina) でスパイクインしました。 その後、TruSeq SR Cluster Kit v3 (Illumina、GD-401-3001) を使用してライブラリープールをクラスター化し、HiSeq 2000 Sequencing System (Illumina) で TruSeq SBS Kit v3 試薬 (Illumina、FC-401-3002) を使用してシーケンスしました。シングルインデックス、1 × 51 bp 長のシングルリードリード (リードパラメーター: Rd1: 52、Rd2: 7)、サンプルあたり平均 2,490 万パスフィルターリードの深さに達します (13.1% CV)。

初代ヒト網膜微小血管内皮細胞 (HRMEC、ACBRI 181、Cell Systems Corporation) を、0.1% ゼラチン (ES-006-B、Millipore) でプレコートしたプレート上の内皮細胞増殖培地 (C-22010、Promocell) 中で培養しました。 細胞は、37 °C、5% CO2 の加湿チャンバー内で培養されました。 アクリジンオレンジ色素（F23002、LogosBio）を備えたLUNA-FLセルカウンター（LogosBio）を、播種前の細胞定量に使用しました。 HRMEC を 10 ng/mL の組換えヒト TNF-α (210-TA-005、RnD Systems) で 37 °C で 24 時間刺激しました。 細胞をＰＢＳで洗浄し、Ｑｉａｇｅｎによって提供されたＲＬＴ緩衝液中で溶解し、製造業者のマニュアルに従ってＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（７４１０６、Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＲＮＡを抽出した。

cDNA合成は大容量cDNAキット（4368814、Applied Biosystems）を使用して行い、qRT-PCRはTaqman Universal PCR Master Mix（4304437、Applied Biosystems）を使用してQuantStudio 6リアルタイムPCRシステム（Applied Biosystems）で実行しました。 相対発現（誘導倍数）はΔΔCT法を使用して計算し、18S（マウス組織の場合）およびPOLR2A（HRMECの場合）遺伝子を正規化対照として使用しました。 この研究では次の Taqman プローブが使用されました: 18S (Hs99999901_s1)、POLR2A (Hs00172187_m1)、Madcam1 (Hs00369968_m1)、CCL2 (Mm00441242_m1)、および V5 タグ (fwd) でヒト コドン最適化 VEGF を検出するカスタムメイドの Taqman プローブプライマー 5’ - ACTGAACGAGAGAACCTGCA -3’、rev プライマー 5’ GCCCAGCAGAGGATTAGGAA-3’、プローブ 5’-CTAGAAGAGGTGGCG-3’）。

C3 発現を検証するための目は、他の場所で公開されている独立したマウス コホートから生成されました 57。 簡単に説明すると、AAV-TNF-αのIVT注射の2週間後に、100μgのゴリムマブ(Simponi)を硝子体内注射した。 AAV注射の6週間後、眼全体を摘出し、液体窒素中で急速冷凍し、プロテイナーゼ阻害剤Pefabloc SC（76307-100MG、Sigma）を補充した溶解緩衝液（9803、Cell Signalling）中で金属ビーズ（15987602、Bertin Technologies）を用いてホモジナイズした。 Precellys Evolution 組織ホモジナイザー (Bertin Technologies) で。 C3発現は、製造業者のプロトコールに従って、Mouse C3 SimpleStep ELISA Kit (ab26388、Abcam)を用いて測定し、SpectraMax Plus 384プレートリーダー(Molecular Devices)を用いて測定した。

組織学的分析用の目は、他の場所で発表された独立した実験で生成されました19。 IVT 注射の 3 ～ 6 週間後に眼を摘出し、4% パラホルムアルデヒド (AR1068、Boster) で 4 °C で 48 時間直接固定しました。 眼を脱水し、キシロール中でインキュベートし、組織処理機械（Tissue-Tek VIP 6、Sakura）を使用してパラフィンを浸潤させた。 免疫組織化学的染色は、Opal Multiplex IHC Kit (Akoya Biosciences) を使用して 3 μm 切片で実行され、自動 Leica Bond プラットフォーム (Leica Biosystems、メルボルン、オーストラリア) で実行されました。 抗原賦活化は、BOND Epitope Retrieval Solution 1 (35608、Leica Biosystems、メルボルン、オーストラリア) を使用して、95 °C、pH 6.0 で 20 分間行いました。 ポリクローナルウサギ抗 CD3 抗体 (ab5690、Abcam) を 1:200 に希釈し、汎 T 細胞マーカーとして使用しました。 OPAL ポリマー抗ウサギ HRP 二次抗体 (ARR1001KT、Akoya Biosciences) および OPAL 570 試薬 (FP1488001KT、Akoya Biosciences) を使用して蛍光シグナルを発生させました。 核をスペクトル DAPI (FP1490、Akoya Biosciences) で染色し、スライドを ProLong Antifade mounting Medium (P36961、Invitrogen) でマウントしました。 免疫蛍光染色は、レーザー走査型顕微鏡 LSM700 (対物レンズ 20 倍、Carl Zeiss Microscopy GmbH) を使用して画像化しました。 ヒト VEGF、TNF-α、および IL-6 の RNAscope in situ ハイブリダイゼーションは、RNAscope 2.5 LSx Red アッセイを使用して、外部の ACDBio/Biotechne で実施されました。 カスタムメイドのプローブは、各 AAV によって発現されるコドン最適化された V5 タグ付きヒト導入遺伝子に基づいて設計されました。 技術的対照として、ACD ポジティブ コントロール (Mm-Ppib、313918、ACDBio) および ACD ネガティブ コントロール (dapB、312038、ACDBio) プローブを使用しました。 ACDBio で、エピトープ回復は 88 °C で 15 分間行われ、タンパク質分解は Protease III を使用して 40 °C で 15 分間行われました。 スライドは、AxioScan.Z1 スライド スキャナー (対物レンズ 20 倍、Carl Zeiss Microscopy GmbH) を使用して画像化されました。

OIR データセットの場合、GRCm38.96 が参照ゲノムとして使用されました。 AAV 研究では、hIL6、hTNFa、および hVEGF のコドン最適化配列をマウス ゲノムにマージすることによってカスタム ゲノムを作成しました。 ゲノムインデックスの生成とリードアライメントは、STAR (バージョン 2.5.2b) を介して実行されました。 遺伝子レベルの定量化は、マルチマッピング読み取りを破棄しながら、FeatureCounts (バージョン 1.5.1) および RSEM (バージョン 1.3.0) を使用して実行されました。 品質管理メトリクスは、特に STAR、picardmetrics (バージョン 0.2.4)、および fastQC (バージョン 0.11.5) から収集された情報とともに、MultiQC (バージョン 1.0) を使用して取得されました。

AAV または OIR 研究のいずれかのサンプル全体でリード カウント値が 10 未満の遺伝子は分析から除外されました。 limma (バージョン 3.44.3) が提供する voom 関数を使用して counts 式の値を正規化しました。 AAV 研究では、ComBat 関数 (sva パッケージ バージョン 3.40.0) を使用して、RNA 抽出バッチ (変数: rna_extraction_batch) に関連する特定されたバッチ効果を修正しました。 主成分分析は、pcaMethods R パッケージ (バージョン 1.80.0) を使用して実行され、最も可変性の高い遺伝子の上位 1000 個を選択しました。

差次的な遺伝子発現は、limma R パッケージによって提供される lmFit 関数を使用して計算されました。 有意に変化する遺伝子は、BH 調整後の p 値 < 0.05 に基づいて選択されました。 経路情報は、misgdbr R パッケージ (バージョン 7.1.1) を使用して取得されました。 遺伝子セット濃縮分析は、Clusterprofiler バージョン 4.0.2 が提供する過剰表現分析 (ORA) 機能を使用して実行されました。 AAV 実験と OIR 研究から得られた遺伝子セット間の直接比較は、stats R パッケージ (バージョン 4.1.0) によって提供される超幾何検定を使用して実行されました。 ベン図は ggvenn (バージョン 0.1.9) を使用してプロットされました。

単一細胞 RNA-Seq データセットは、GSE1352229、GSE130636、および GSE135922 から取得されました。 必要に応じて、ホスト パラメーターを http://feb2021.archive.ensembl.org/ に設定して、biomaRt R パッケージ (2.48.2) を使用して、ヒト アンサンブル ID をマウス ホモログにマッピングしました。 Raw カウントは、Seurat R パッケージ (バージョン 4.0.3) を使用してさらに処理されました。 細胞特異的遺伝子は、FindMarkers 関数を介して個々のデータセットおよび細胞タイプごとに特定されました。 BH 調整後の p 値 < 0.01 で、遺伝子が他の細胞型に特異的であると同定されなかった場合 (固有の遺伝子のみ)、遺伝子は細胞特異的であると定義されました。 上記のように、細胞特異的マーカー遺伝子と、AAV または OIR 研究に由来する遺伝子セット間の重複は、clusterProfiler の ORA 機能部分によって定量化されました。

すべてのデータは Gene Expression Omnibus (GEO) データベースに保管されており、GSE200191 および GSE200195 に基づいて利用できます。 この研究に使用されたコードは、https://github.com/bi-compbio/AAV_retinopathy_models で入手できます。

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すべての AAV in vivo 実験に関して優れた技術援助をしていただいた Manuel Deubler、Jürgen Haller、Jan Hering、Oliver Da Cruz Rodrigues Radmacher、および OIR 実験について Heike Bühler、Sabine Baierl、Martin Steiner に非常に感謝しています。 AAV の生成は、Benjamin Strobel とベーリンガーインゲルハイムの AAV 研究室によって支援されました。 AAV 研究用のカスタム ゲノム ファイルの作成を支援してくれた Daniel Gerlach と、組織学的分析をサポートしてくれた Tanja Schönberger に感謝します。 実りある科学的議論をしてくださった Elke Markert 氏と Thomas Ciossek 氏に感謝します。 図 1a は BioRender.com で生成されました。

Kolja Becker と Carina M. Weigelt の著者も同様に貢献しました。

著者ホルガー・クラインとノーバート・H・レデマンが共同でこの作品を監修しました。

Global Computational Biology & Digital Sciences、Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG、ビーベラッハ アン デア リス、ドイツ

コーリャ・ベッカー、コラリー・ヴァイオレット、ヴェルナー・ルスト、フランセスク・フェルナンデス＝アルバート、エリック・サイモン、ホルガー・クライン

心臓代謝疾患研究、Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG、ビーベラッハ アン デア リス、ドイツ

カリーナ M. ヴァイゲルト、ホルガー フックス、ニーナ ジッペル、レムコ A. バッカー & ノーベルト H. レデマン

Drug Discovery Sciences、Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG、ビーベラッハ アン デア リス、ドイツ

ハンナ・ワイアット & トーステン・ラムラ

臨床開発および運営会社、Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG、ビーベラッハ アン デア リス、ドイツ

ヨッヘン・フーバー

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KB と CMW は実験を計画し、結果を解釈し、原稿を書き、図を作成しました。 KB はバイオインフォマティクス分析を実施し、CMW は in vivo および in vitro 実験を実施しました。 CV と WR は RNA シークエンシングを設計および実行し、HW は組織学的分析をサポートし、TL は AAV 生成をサポートしました。 HF と JH は in vivo 実験を監督し、NZ は in vitro 実験をサポートしました。 FF、RAB、HK、NHR がプロジェクトを監督し、原稿を改訂しました。 著者全員が原稿を読み、改訂に貢献しました。

コーリャ・ベッカー氏への通信。

著者は全員ベーリンガーインゲルハイムの従業員であり、この研究はベーリンガーインゲルハイムから全額資金提供を受けています。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

Becker, K.、Weigelt, CM、Fuchs, H. 他マウスの目にヒト VEGF、TNF-α、IL-6 を発現する AAV 誘発網膜症モデルのトランスクリプトーム解析。 Sci Rep 12、19395 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-23065-4

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受信日: 2022 年 4 月 20 日

受理日: 2022 年 10 月 25 日

公開日: 2022 年 11 月 12 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-23065-4

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