エンパグリフロジンはナトリウムを介して心臓線維形成を抑制した

Cardiovascular Diabetology volume 22、記事番号: 27 (2023) この記事を引用

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新しいナトリウム-グルコース共輸送体 2 阻害剤 (SGLT2i) は、心不全を改善し、不整脈を軽減する可能性があります。 心臓線維症は、HF および心房ミオパチーの病態生理学において極めて重要な役割を果たしていますが、線維形成に対する SGLT2i の影響はまだ解明されていません。 この研究では、SGLT2i が線維芽細胞の活性とその根底にあるメカニズムを直接調節するかどうかを調査しました。

遊走、増殖分析、細胞内 pH アッセイ、細胞内イノシトール三リン酸 (IP3) アッセイ、Ca2+ 蛍光イメージング、およびウェスタンブロッティングをヒト心房線維芽細胞に適用しました。 エンパグリフロジン (SGLT2i、1 または 5 μmol/L) は、遊走能力と I 型および III 型コラーゲンの産生を減少させました。 対照細胞と比較して、エンパグリフロジン（1 μmol/L）で処理した心房線維芽細胞は、小胞体（ER）の Ca2+ 漏出、Ca2+ 流入、イノシトール三リン酸（IP3）の低下、リン酸化ホスホリパーゼ C（PLC）の発現の低下、および細胞内 pH の低下を示しました。 カリポリド (Na+-H+ 交換体 (NHE) 阻害剤、10 μmol/L) の存在下では、対照およびエンパグリフロジン (1 μmol/L) で処理した心房線維芽細胞は、同様の細胞内 pH、ER Ca2+ 漏出、Ca2+ 流入、リン酸化 PLC、プロコラーゲン I 型、III 型タンパク質の発現、および遊走能力。 さらに、エンパグリフロジン（10 mg/kg/日、連続28日間経口投与）は、イソプロテレノール（100 mg/kg、皮下注射）誘発HFラットにおいて、左心室収縮機能、β-ヒドロキシ酪酸を有意に増加させ、心房線維症を減少させた。

エンパグリフロジンは、NHE を阻害することにより、リン酸化 PLC の発現と IP3 産生を減少させ、それにより ER Ca2+ 放出、細胞外 Ca2+ 流入、および心房線維芽細胞の線維化促進活性を減少させます。

ナトリウム-グルコース共輸送体 2 阻害剤 (SGLT2i) は、心不全 (HF) および 2 型糖尿病患者の心血管死および入院のリスクを軽減する新しいクラスの抗糖尿病薬です [1、2]。 SGLT2i は心臓の線維化を軽減し、心臓機能を改善する可能性があります [3、4]。 心房線維症は、心房ミオパチーおよび心房不整脈誘発の明確かつ重要な特徴である[5、6]。 HF患者は心房線維症の発生率が高く、SGLT2iは左心房充満圧を低下させ、運動耐容能と拡張機能を増加させますが、これらすべては心房線維症と相関しています[7、8、9、10、11、12]。 しかし、SGLT2i が心房線維形成を調節するかどうか、またどのように調節するかは依然として不明である。

カルシウム (Ca2+) シグナル伝達経路は線維形成において重要な役割を果たし、線維芽細胞の増殖、コラーゲン産生、遊走、および筋線維芽細胞分化能力を誘導します [13、14、15、16]。 SGLT2i は、Na+/H+ 交換体 (NHE) の細胞外 Na+ 結合部位と直接相互作用することができ、それにより NHE 活性を低下させ、細胞内 pH を低下させます [17]。

細胞内 pH の上昇は、小胞体 (ER) の Ca2+ 漏出または Ca2+ 流入を通じてサイトゾル Ca2+ を誘導することが証明されています [18、19]。 NHE 活性は HF 患者で上方制御されており [20、21]、カリポライドによる NHE 阻害は HF の心線維化を減少させます [22、23、24]。 NHE1 活性の増加は細胞内 pH を上昇させ、細胞遊走能力を活性化します [21、25]。 ダパグリフロジンはNHE1遺伝子発現を減弱させます[26]。 したがって、SGLT2i は NHE シグナル伝達を阻害することで線維形成を直接抑制し、抗線維症の可能性をもたらす可能性があります。 この研究の目的は、SGLT2i の一種であるエンパグリフロジンが心房線維形成を減少させる可能性があるかどうかを調べ、その根底にあるメカニズムを研究することでした。

ヒト心房線維芽細胞は、Lonza Research Laboratory (米国メリーランド州ウォーカーズビル) から購入しました。 線維芽細胞を、FGM™-3 Cardiac Fibroblast Growth Medium-3 BulletKit (Lonza、HEPES: 14.999 mmol/L および重炭酸ナトリウム: 14.010 mmol/L を含む) 中の単層として、37 °C、5% CO2 でコーティングされていない培養皿に播種しました。 細胞機能の変動の可能性を避けるために、継代 4 ～ 6 の細胞を使用しました。 SGLT2 はウェスタンブロットにより細胞内に存在することが示されました (追加ファイル 1: SGLT2 タンパク質発現の図 S1)。

心房線維芽細胞の遊走は、創傷治癒アッセイを使用して研究されました。 簡単に説明すると、細胞を 6 ウェルプレートに播き、エンパグリフロジン (1 または 5 μmol/L、MedChemExpress、ニュージャージー州、米国) または NHE 阻害剤 (カリポリド、10 μmol/L、Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国) で処理しました。 ）無血清培地で48時間、72時間。 処理終了の6時間前に、P200ピペットチップの先端を使用して細胞をこすり落とした。 ギャップの各領域は、Image J 1.45 s ソフトウェア (米国メリーランド州ベセスダの国立衛生研究所) を使用して評価されました。 6時間後の正味移行面積を、最初のスクラッチ時のものから差し引いた。

心房線維芽細胞の増殖は、以前に記載されているように、市販の MTS キット (Promega、米国ウィスコンシン州マディソン) を使用して測定しました [27]。 簡単に説明すると、心房線維芽細胞を 3000 細胞/ウェルの密度で 96 ウェル培養皿に播種しました。 50％コンフルエンスまで増殖させた後、細胞を培地中でエンパグリフロジン（1μmol/L、5μmol/L）とともに24時間インキュベートした。 分光光度分析の4時間前にMTS試薬を添加することにより、細胞増殖を分析しました。

ウェスタンブロッティングは以前に記載されているように実行されました[28]。 エンパグリフロジン (1 または 5 μmol/L)、またはカリポライド (10 μmol/L) の有無にかかわらず 48 時間処理した心房線維芽細胞を、150 mmol/L NaCl、Nonidet P P40、50 mmol/L Tris pH を含む放射免疫沈降アッセイ緩​​衝液で溶解しました。 ７．４、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）およびプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）。 10% SDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用してタンパク質を分画し、平衡化したポリ二フッ化ビニリデン膜 (Amersham Biosciences、バッキンガムシャー、英国) に転写しました。 分画されたタンパク質は、α-平滑筋アクチン (SMA) (1:1000、モノクローナル、クローン番号: 1A4、Abcam)、プロコラーゲン タイプ IA1 (1:500、モノクローナル、クローン番号: 3G3、Santa-) に対する一次抗体でプローブされました。 Cruz Biotechnology、サンタクルーズ、カリフォルニア州、米国）、プロコラーゲン III 型（1:1000、モノクローナル、クローン番号: FH7A、Abcam）、NHE1（1:1000、ポリクローナル、Alomone Labs、エルサレム、イスラエル）、およびリン酸化 PLCγ1 （1:1000、ポリクローナル、細胞シグナル伝達、ビバリー、マサチューセッツ州、米国）、続いて西洋わさびペルオキシダーゼと結合した二次抗体とインキュベートしました。 結合した抗体は、強化化学発光検出システム (Millipore、ダルムシュタット、ドイツ) を使用して検出し、AlphaEaseFC ソフトウェア (Alpha Innotech、サン リアンドロ、カリフォルニア州、米国) を使用して分析しました。 グリセルアルデヒド 3-リン酸デヒドロゲナーゼ (GAPDH) タンパク質 (Sigma-Aldrich) をローディング コントロールとして使用して、タンパク質ローディングが等しいことを確認し、その後、コントロール細胞の値に正規化しました。

細胞内 pH は、Cell Meter Fluorometric 細胞内 pH アッセイ キット (AAT Bioquest、米国カリフォルニア州サニーベール) を製造業者の指示に従って使用して計算しました。 簡単に言うと、心房線維芽細胞を96ウェル培養黒色プレート上に3000細胞/ウェルの密度で播種した。 コンフルエンスまで増殖した後、細胞をエンパグリフロジン (1 μmol/L) またはカリポライド (10 μmol/L) とともに 6 時間インキュベートしました。 20 mM HEPESおよび4.17 mM 重炭酸ナトリウムを含むハンクス緩衝液中のpH感受性細胞透過性蛍光色素20,70-ビスカルボキシエチル-5,6-カルボキシフルオレセイン-アセトキシメチルエステル（BCECF-AM）を細胞に37℃で1時間ロードしました。 °C、5% CO2、暗所。 その後、リン酸緩衝食塩水（PBS）で洗浄した後、SpectraMax M2 蛍光光度計（Molecular Devices、サニーベール、カリフォルニア州、米国）で 505/535 nm および 430/535 nm の励起/発光波長 (Ex/Em) で蛍光を測定しました。 。 505/535 nm および 430/535 nm での蛍光の比は、Spexyte 細胞内 pH キャリブレーション バッファー キット (AAT Bioquest) を使用して pH 単位に変換されました。 BCECF-AM を負荷した心房線維芽細胞を、外部 pH で細胞内 pH を調節できるプロトンイオノフォアであるナイゲリシン (10 mmol/L) とともに、一連のキャリブレーションバッファー (pH 4.5 ～ 8.0) で 37 °C で 10 分間インキュベートしました。 100 〜 150 mmol/L の K+ の存在。

細胞内 Ca2+ は、以前に記載されているように、蛍光プレートリーダーを使用してレシオメトリック Ca2+ インジケーター Fura-2 で測定されました [29]。 心房線維芽細胞を透明な平底黒色 96 ウェル培養プレートに 5 × 103 細胞/ウェルの密度で播種し、一晩インキュベートした後、細胞をエンパグリフロジン (1 μmol/L) またはカリポライド (10 μmol/L) の有無にかかわらず処理しました。 L）48時間。 次に、KH2PO4 1.2、NaCl 120、MgSO4 1.2、KCl 5.4、HEPESを含むCa2+フリー溶液中の5μmol/L Fura-2アセトキシメチルエステル（Life Technologies、米国カリフォルニア州カールズバッド）で細胞を染色しました。 6、グルコース 10 (pH 7.40)、5% CO2 インキュベーター内、37 °C で 30 分間。 細胞内 Ca2+ の測定は、2 つのインジェクターを備えた CLARIOstar PLUS Microplate Reader (BMG Lab Technologies, USA) を使用して、励起波長 340 および 380 nm の高速切り替えと 510 nm の一定発光波長で 2 秒ごとに実行され、分析されました。 CLARIOstar MARS ソフトウェア (BMG Lab Technologies)。 各ウェルの細胞内 Ca2+ 濃度を F340/F380 の蛍光比として表し、ベースラインからピークカルシウム振幅までの変化、および Ca2+ トレースの曲線下面積 (AUC) を計算しました。 Ca2+ 流入の減衰時間 (T50) は、ピークから減衰の 50% まで計算されました。

ベースラインの細胞内 Ca2+ を Ca2+ フリーのバッファーで 2 分間記録し、その後 ER Ca2+ 貯蔵枯渇のために ER Ca-ATPase 阻害剤 (タプシガルジン、2.5 μmol/L、Sigma-Aldrich) で共処理しました。 タプシガルギン誘発性 ER Ca2+ 漏出による細胞内 Ca2+ の急増が定常状態に戻った後、細胞外 Ca2+ 濃度を 2 mmol/L に増加させて Ca2+ 流入を測定しました。 細胞外 Ca2+ 非含有の定常状態からタプシガルギン共治療のプラトー状態までの細胞内 Ca2+ の変化 (Δ F340/F380) を、ER Ca2+ 枯渇量および ER 後の Ca2+ 誘導の定常状態からの変化として定義しました。 2 mmol/L Ca2+ 溶液下でのプラトー状態への細胞内 Ca2+ サージを、Ca2+ 流入を表すために使用しました。

エンパグリフロジン（1μmol/L）またはカリポライド（10μmol/L）の有無にかかわらず処理した心房線維芽細胞の細胞溶解物を、製造業者の指示に従ってヒトIP3 ELISAキット（Amsbio、Abingdon、UK）を使用してIP3産生についてアッセイしました。 各処理の細胞溶解物からのタンパク質濃度を正規化に使用しました。

HF 誘導は以前に記載されているように実施されました [30]。 雄の Wistar ラット (体重 300 ～ 350 g) に高用量のイソプロテレノール (100 mg/kg) を単回皮下注射しました。 注射の 2 週間後、これらのラットの左心室短縮率 (LVFS) を心エコー検査によって分析しました。 LVFS < 45% のラットは HF グループに含まれました [31]。 次に、HF ラットをエンパグリフロジン (10 mg/kg/日、28 日間、Jardiance、Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals、リッジフィールド、コネチカット州、米国) またはビヒクルでランダムに治療しました。 28日間の治療の完了後、組織学的分析のために、治療を受けたラットと年齢を一致させた健康な雄対照ラットの両方を5%イソフルラン(酸素中)の過剰摂取で安楽死させた。 すべての動物プロトコルは、米国国立衛生研究所によって発行された実験動物の管理と使用に関するガイド (NIH Publication No. 85-23、2011 年改訂) に準拠しており、地元の動物倫理審査委員会によって承認されました (LAC-2021- 0223）。 動物実験は、ARRIVE ガイドライン [32] および British Journal of Pharmacology の推奨事項 [33] に従って報告されています。

安楽死の前に心エコー検査が行われました。 ラットを 2% イソフルラン (酸素中) で鎮静し、左側臥位に置き、10S フェーズド アレイ小児トランスデューサと市販のエコー スキャナ (Vivid i 超音波心臓血管システム、GE Healthcare、イスラエル、ハイファ) を使用してスキャンしました。高い時間的および空間的解像度を備えた心臓アプリケーション。 送信周波数は 10 MHz でした。 深さ2.5cm。 フレームレートは225フレーム/秒です。 左室拡張末期直径 (LVEDD)、左室収縮末期直径 (LVESD)、左室後壁厚さ (LVPW)、および心拍数 (HR) を測定しました。 短縮率(%)は、(LVEDD-LVESD)/LVEDD×100として測定されました。

安楽死の前に血清を収集し、製造者の指示に従ってβ-OH蛍光分析キット(Cayman Chemical Co、米国ミシガン州アナーバー)を使用してβ-OHをアッセイした。

心房線維症の分析は、以前に記載された方法に修正を加えて実行されました[30]。 簡単に説明すると、左心房 (LA) 組織を 4% ホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋し、マッソントリクローム染色で染色しました。 LA組織の明視野画像が得られました。 LA 線維症は、コラーゲン体積分率 (総 LA 表面積に対する総コラーゲン表面積の比) を使用して評価されました。 HistoQuest Analysis Software (バージョン 4.0、TissueGnostics、ウィーン、オーストリア) を使用して、切片化された LA 組織全体のコラーゲン沈着を盲検的に評価しました。

すべての定量的データは、平均値 ± 平均値の標準誤差として表されます。 正規分布に対する対応のあるまたは対応のない t 検定、非正規分布に対するマン・ホイットニー順位和検定、および事後フィッシャーの最小有意差 (LSD) 検定を使用したランク上の一元配置分散分析または反復測定分散分析または分散分析異なる条件下で心房線維芽細胞を比較するために使用されました。 AP < 0.05 は統計的に有意であるとみなされました。

対照細胞と比較して、エンパグリフロジン（1 または 5 μmol/L）で処理した心房線維芽細胞は遊走能力が低く、用量依存的にプロコラーゲン I 型および III 型タンパク質の発現が低下しました（図 1）。 しかし、対照心房線維芽細胞とエンパグリフロジン処理心房線維芽細胞は、同様のα-SMA（筋線維芽細胞分化マーカー）発現および増殖速度を示しました（図1）。

エンパグリフロジンで処理した心房線維芽細胞の細胞遊走、コラーゲン産生、筋線維芽細胞の分化、増殖能力。 A 写真と平均データにより、エンパグリフロジン (1 または 5 μmol/L) で処理した心房線維芽細胞の遊走アッセイの結果が明らかになりました。 左上のパネルには、さまざまなグループの初期スクラッチ (ベースライン) が表示されます。 左下のパネルは、スクラッチが作成されてから 6 時間後 (移動後) の画像を表示しました (n = 6 回の独立した実験、一元配置反復測定 ANOVA による統計検定)。 B 写真および平均データは、対照およびエンパグリフロジン (1 または 5) におけるプロコラーゲン I、III 型、および α-平滑筋アクチン (SMA) の発現を明らかにしました (n = 6 の独立した実験、一元配置反復測定 ANOVA による統計検定) μmol/L) 処理した心房線維芽細胞。 GAPDHをローディングコントロールとして使用しました。 C 24時間のエンパグリフロジン治療は、心房線維芽細胞の増殖速度に有意な影響を及ぼさなかった(n = 6の独立した実験、一元配置反復測定ANOVAによる統計検定)。 * p < 0.05、# p < 0.01、$ p < 0.005

結果セクションの図の凡例。

エンパグリフロジン (1 μmol/L) で処理した心房線維芽細胞は、対照細胞と比較して、タプシガルギン誘発性 ER Ca2+ 漏出、細胞外 Ca2+ 流入が低く、Ca2+ 流入期の Ca2+ 減衰が短いことを示しました (図 2) エンパグリフロジン (1 μmol/L) 心房線維芽細胞リン酸化PLCおよびIP3の発現が低下しました（図2）。

エンパグリフロジン処理心房線維芽細胞における細胞内 Ca2+ シグナル伝達。 対照（左上のパネル）およびエンパグリフロジン（1μmol/L、右上のパネル）で処理した心房線維芽細胞からの代表的な細胞内Ca2+トレース。 示されている場合、タプシガルギンをカルシウムを含まない緩衝液に添加して、ER Ca2+枯渇を誘導した。 タプシガルギン（ER カルシウム）によって誘発された細胞内 Ca2+ サージが定常状態に戻った後、細胞外 Ca2+ 濃度を 2 mmol/L に増加させて Ca2+ 流入を測定しました。 F340/F380 は相対的な細胞内 Ca2+ として表現されました。 左下のパネルは、Ca2+ トレースの曲線下面積 (AUC、対応のない t 検定による統計検定) によって測定された Ca2+ の変化 (Δ F340/F380)、ベースラインからピークカルシウム振幅までの変化 (Mann-Whitney による統計検定) を表示します。ランク合計テスト）、および対照における Ca2+ 流入の減衰時間（T50、ピークから減衰の 50% またはカルシウム画像記録の終了まで計算、対応のない t 検定による統計検定）（n = 5）およびエンパグリフロジン処理された心房線維芽細胞（n = 5）。 B エンパグリフロジン (1 μmol/L) で 48 時間処理した対照細胞および線維芽細胞における IP3 レベルの平均データ (n = 6 実験、ペア t 検定による統計検定)。 C エンパグリフロジン（1μmol/L）で48時間処理した対照細胞および線維芽細胞におけるリン酸化ホスホリパーゼC（pPLC）の発現の写真および平均データ（n = 6の独立した実験、対応のあるt検定による統計検定）。 GAPDHをローディングコントロールとして使用しました。 * p < 0.05、# p < 0.01、$ p < 0.005

対照細胞と比較して、エンパグリフロジン処理 (1 μmol/L) 心房線維芽細胞は、より低い細胞内 pH を示しましたが、NHE1 タンパク質の発現は同様でした (図 3)。 カリポリド (NHE 阻害剤、10 μmol/L) の存在下では、コントロールとエンパグリフロジンで処理した心房線維芽細胞は、同様のレベルの細胞内 pH、リン酸化 PLC、NHE1 の発現、I 型、III 型コラーゲンの産生、遊走能力を示しました。図 3 および 4）、ER Ca2+ 漏出、細胞外 Ca2+ 流入、Ca2+ 流入期の T50（図 5）は、エンパグリフロジンが阻害を通じて PLC/IP3 受容体/ER Ca2+ シグナル伝達を弱めることにより、心房線維芽細胞の線維化活性を低下させたことを示唆しています。 NHEシグナル伝達経路の説明。

Na+/H+ 交換体 (NHE) および下流シグナル伝達に対するエンパグリフロジンの影響。 A カリポライド (10 μmol/L) の存在下または非存在下で 48 時間共処理した対照細胞およびエンパグリフロジン (1 μmol/L) 処理心房線維芽細胞における細胞内 pH の平均データ (n = 6 実験、一元配置反復による統計検定) ANOVA を測定します)。 B カリポライドの存在下または非存在下で共処理した対照細胞およびエンパグリフロジン (1 μmol/L) 処理心房線維芽細胞におけるプロコラーゲン I 型、III 型、リン酸化ホスホリパーゼ C (pPLC)、および NHE1 タンパク質の発現の写真と平均データ (10 μmol/L) を 48 時間 (n = 6 実験、一元配置反復測定 ANOVA による統計検定)。 GAPDHをローディングコントロールとして使用しました。 * p < 0.05、$ p < 0.005

エンパグリフロジンに対する Na+/H+ 交換体阻害剤 (カリポライド) の効果は、心房線維芽細胞の遊走を減少させました。 写真および平均データは、カリポライド (10 μmol/L) の有無にかかわらずエンパグリフロジン (1 μmol/L) で処理した心房線維芽細胞の遊走アッセイの結果を示しています。 上のパネルには、さまざまなグループの初期スクラッチ (ベースライン) が表示されます。 下のパネルは、スクラッチが作成されてから 6 時間後 (移動後) の画像を表示します (n = 6 回の独立した実験、一元配置反復測定 ANOVA による統計検定)。 * p < 0.05、# p < 0.01、$ p < 0.005

エンパグリフロジンまたはカリポライドで処理した心房線維芽細胞における細胞内 Ca2+ シグナル伝達。 カリポライド単独 (10 μmol/L、左上のパネル)、およびエンパグリフロジンと混合したカリポライド (10 μmol/L、右上のパネル) からの代表的な細胞内 Ca2+ トレース。 示されている場合、タプシガルギンをカルシウムを含まない緩衝液に添加して、ER Ca2+枯渇を誘導した。 タプシガルギン（ER カルシウム）によって誘発された細胞内 Ca2+ サージが定常状態に戻った後、細胞外 Ca2+ 濃度を 2 mmol/L に増加させて Ca2+ 流入を測定しました。 F340/F380 は相対的な細胞内 Ca2+ として表現されました。 左下のパネルは、Ca2+ トレース（AUC、対応のない t 検定による統計検定）の曲線下面積によって測定された Ca2+ の変化（Δ F340/F380）、ベースラインからピークカルシウム振幅までの変化（統計検定による統計検定による）を表示します。対応のない t 検定）、およびカリポライド単独での Ca2+ 流入の減衰時間（T50、ピークから減衰の 50% またはカルシウム画像記録の終了まで計算、対応のない t 検定による統計検定）（n = 5) およびエンパグリフロジン処理心房線維芽細胞と混合したカリポライド (n = 5)

図6Aに示すように、本発明者らは、インビボでの心臓構造、収縮機能、血清β-OH、および心房線維症に対するエンパグリフロジンの影響を研究した。 心エコー検査所見により、ビヒクルを投与されたイソプロテレノール処置ラットは、対照ラットよりも低いＬＶ収縮機能（ＬＶＦＳ）、および同様のＬＶＰＷ、ＬＶＥＤＤ、およびＨＲを有するＬＶＥＳＤを示すことが明らかになった。 エンパグリフロジンを投与されたイソプロテレノール処置ラットは、ビヒクルを投与されたイソプロテレノール処置ラットと比較して、同等のLVESD、LVEDD、およびHRを有するより高いLV収縮機能(LVFS)を示した(図7)。

イソプロテレノール誘発性心不全（HF）のラットに対するエンパグリフロジンの効果。 イソプロテレノール（１００ｍｇ／ｋｇ、皮下注射）誘発ＨＦ投与ビヒクルによるウィスターラット、エンパグリフロジン（１０ｍｇ／ｋｇ／日を連続２８日間経口投与）を受けたＨＦラット、および対照ラットの治療プロトコールをまとめた概略図。 B の平均データは、ビヒクルを投与された HF ラット (n = 5)、エンパグリフロジンを投与された HF ラット (n = 5)、および対照ラット (n = 5) における β-ヒドロキシ酪酸の血清レベルの結果 (一元配置 ANOVA による統計検定) を示しています。 ）。 C 写真は、異なるグループの左心房 (LA) 組織におけるマッソントリクローム染色 (一元配置 ANOVA による統計検定) を使用して研究した心房線維症 (青色で染色) を示しています。 エンパグリフロジンを投与された対照ラット（n = 5）およびHFラット（n = 5）は、ビヒクルで処理されたHFラット（n = 5）よりも軽度のLA線維症を示しました。 LA 組織の線維化レベルは、コラーゲン体積分率、つまり、青く染色された LA 総コラーゲン表面積と LA 総表面積の比として表されました。 * p < 0.05、# p < 0.01、$ p < 0.005

イソプロテレノール誘発性心不全（HF）のラットの心臓構造、収縮機能、心拍数に対するエンパグリフロジンの影響。 写真と平均データは、左心室短縮率（LVFS、一元配置分散分析による統計検定）、LV後壁（LVPW、一元配置分散分析による統計検定）、左室拡張末期直径（LVEDD、統計検定による）の結果を示しています。ランクに関する分散分析）、LV 収縮終期直径（LVESD、一元配置分散分析による統計検定）、心拍数（HR、一元配置分散分析による統計検定）、ビヒクルを投与された HF ラット（n = 5）、溶媒を投与された HF ラットにおける心拍数（HR、一元配置分散分析による統計検定）エンパグリフロジン (n = 5)、および対照ラット (n = 5)。 * p < 0.05、$ p < 0.005

β-OH の血清レベルから、エンパグリフロジンを投与されたイソプロテレノール処理ラットは、安楽死前のビヒクルで処理された HF および健康な対照ラットよりも血清 β-ヒドロキシ酪酸濃度が高いことが明らかになりました (図 6B)。 マッソントリクローム染色は、イソプロテレノール処置ラットが対照ラットよりも高いLA線維症を示し、エンパグリフロジンがイソプロテレノール処置ラットにおいてLA線維症を有意に減少させたことを示した(図6C)。

エンパグリフロジンは、さまざまな心不全実験モデルで心臓線維症を改善することが実証されています[4]が、抗線維形成効果の根底にあるメカニズムは完全には解明されていません。 私たちの知る限り、これはエンパグリフロジン (1 μmol/L) がヒト心房線維芽細胞の NHE 活性を阻害することによって Ca2+ 恒常性を妨害し、それによって線維化促進性の細胞活性を低下させることを報告した最初の研究です。 NHE が過剰発現している心筋細胞は、細胞内 pH が高くなりました。 NHE 過剰発現マウスは HF および心臓線維症を示しましたが、これは NHE1 阻害剤カリポライドによって改善できる可能性があります [34]。 この研究では、エンパグリフロジンが心臓の主要なアイソフォームであるNHE1タンパク質の発現を変えることなく、心房線維芽細胞の細胞内pHを低下させることを観察しました[35]。 さらに、エンパグリフロジンを含むカリポライドとエンパグリフロジンを含まないカリポライドは、心房線維芽細胞の線維化促進性細胞活性を同程度に低下させ、エンパグリフロジンがNHEシグナル伝達の活性化を弱めることによって心房線維芽細胞の活性を低下させる可能性があることを示唆しています。

細胞内 pH の上昇は PLC/IP3 受容体シグナル伝達経路を活性化し、それによって ER Ca2+ 放出または Ca2+ 流入を誘導します [36]。 線維化促進サイトカインは、PLC/IP3 受容体シグナル伝達経路を介してコラーゲン分泌を誘導しますが、PLC シグナル伝達経路の阻害はコラーゲン産生能力を低下させます [37]。 本研究では、エンパグリフロジンが細胞内 pH、リン酸化 PLC、および細胞内 IP3 を有意に低下させることを発見しました。 さらに、エンパグリフロジンを含むカリポライドとエンパグリフロジンを含まないカリポライドは、細胞内 pH を低下させ、心房線維芽細胞のリン酸化 PLC を同程度に低下させました。 これらの所見は、エンパグリフロジンがNHEシグナル伝達の阻害を通じてPLC/IP3受容体シグナル伝達経路を阻害することにより、心房線維形成を軽減する可能性があることを示唆しています。 同様に、心房筋細胞では、エンパグリフロジンへの急性曝露により細胞内 pH が低下し、NHE 活性が減弱しました。 この弱毒化は、カリポライドとのインキュベーションによっても達成されました[38]。 エンパグリフロジンは NHE フラックスを大幅に減衰させ、それにより心室筋細胞の細胞質の Na+ および Ca2+ を減少させた [39]。 カリポライドの存在下では、心房線維芽細胞におけるエンパグリフロジンの減弱効果が強く抑制され、NHE阻害効果がカリポライドと同等であることが示唆された。

私たちの以前の研究では、エンパグリフロジンが糖尿病性筋細胞における筋小胞体 (SR) Ca2+ 含有量の減少を軽減することがわかりました [3]。 さらに、エンパグリフロジンは SR Ca2+ 漏出も減少させる可能性がある [40]。これは、エンパグリフロジンが ER Ca2+ 漏出を減少させる可能性があることを示唆しています。 ER Ca2+ 漏出の阻害は、線維化促進サイトカインの下流シグナル伝達を遮断する [37] 本研究では、エンパグリフロジンがタプシガルギン誘発性 ER Ca2+ 放出を減少させることが判明し、エンパグリフロジンが細胞内 pH を低下させることによって PLC/IP3/ER Ca2+ 放出シグナル伝達経路を下方制御することを示唆している。 NHE の阻害により、コラーゲン生成が減少します。 PLC の Ca2+ 依存性活性化は、さまざまな細胞で証明されています [41、42]。 高 Ca2+ 溶液で虚血性心筋を灌流すると PLC 活性が増加するのに対し、Ca2+ チャネル遮断薬で灌流すると PLC 活性が減少します [43]。 SGLT2iは、後期ナトリウムチャネル（Nav1.5）に直接ドッキングし、NHE流入を阻害し、NCXのリバースモードを阻害することにより、細胞内Na+を減少させ、それにより心筋細胞の細胞内Ca2+含有量を減少させた[39、44、45]。 本研究では、エンパグリフロジンがサイトゾル Ca2+ を有意に減少させることを発見しました。 したがって、PLC 活性の低下に対するエンパグリフロジンの効果は、エンパグリフロジンで処理された心房線維芽細胞におけるサイトゾル Ca2+ の減少によっても引き起こされる可能性があります。 Ca2+ 流入のゲートウェイには、Orai チャネル、一過性受容体電位 (TRP) チャネル、電圧作動性 Ca2+ チャネル、または NCX が含まれます。 Orai チャネルシグナル伝達の減衰は、心房線維芽細胞のコラーゲン産生能力を低下させます [46]。 トランスフォーミング成長因子は、TRP チャネルを通じて心房線維芽細胞の線維化促進活性を活性化します [47]。 ER Ca2+ が空になると、Orai チャネルが活性化される可能性があります [48、49]。 TRP チャネルは PLC 信号によってアクティブ化できます [50、51]。 以前の研究では、SGLT2i が TRP チャネルの阻害を通じて塩誘発性の高い血管収縮を減少させることが明らかになりました [45]。 SGLT2i は、心筋細胞の L 型 Ca2+ チャネル (電位作動性 Ca2+ チャネルの一種) を介して Ca2+ 過負荷を軽減することもできます [52]。 本研究では、エンパグリフロジンがER Ca2+排出、PLC活性、および細胞外Ca2+流入を減少させることを発見した。 さらに、エンパグリフロジンを含むカリポライドとエンパグリフロジンを含まないカリポライドは、ER Ca2+漏出と心房線維芽細胞の細胞外Ca2+流入を同程度に減少させ、エンパグリフロジンが減少する可能性を示唆し、エンパグリフロジンがNHEシグナル伝達経路の阻害を通じてサイトゾルCa2+を減少させることを示唆した。

細胞質 Ca2+ の押し出しは、細胞膜 ATPase (PMCA) および細胞膜上の順方向モード Na+/Ca2+ 交換体を介した Ca2+ 流出によって、または ER 膜上の SR Ca2+-ATPase (SERCA) を通じて Ca2+ を ER にポンプで戻すことによって行うことができます。 細胞内 pH の上昇は、SERCA の ER Ca2+ 再取り込み能力を阻害することが証明されています [53]。 本研究では、エンパグリフロジンが Ca2+ 流入期の減衰時間を短縮することを発見しました。 さらに、カリポライドはエンパグリフロジンの有無にかかわらず、心房線維芽細胞の Ca2+ 流入期の減衰時間を同程度に短縮しました。 したがって、エンパグリフロジンはSERCA機能を強化し、ER Ca2+再取り込みを増加させ、それにより細胞内pH低下効果を介して心房線維芽細胞のCa2+流入期の減衰時間を短縮する可能性がある。

エンパグリフロジンによる NHE の阻害は、細胞内 Ca2+ を減少させ、心臓の収縮を減少させる可能性があります。 しかし、以前の研究では、エンパグリフロジンが糖尿病心筋細胞におけるHFを弱め、Ca2+含有量を増加させることが示されており、これはSERCA発現とL型カルシウム電流に対するエンパグリフロジンの増強効果から生じるものと考えられている[3]。 エンパグリフロジンによる NHE 活性の低下は、酸化ストレスを軽減し、心臓保護効果をもたらす可能性があります [3]。 さらに、線維形成の減少により HF が改善されます [54、55]。 したがって、エンパグリフロジンは、その抗線維症の可能性と変力作用（SERCA機能と心筋細胞のCa 2+ 含有量の強化）を通じてHFを改善する可能性があります。 イソプロテレノールは、Ca2+/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼ II (CaMKII) シグナル伝達を活性化し、異常な Ca2+ スパーク周波数を誘発し、それによって機能不全の心における不整脈の発生を誘発します [56、57]。 エンパグリフロジンは、Ca2+ チャネル [52]、Na+ チャネル [44]、K+ チャネル [58] などのさまざまなイオンチャネルを調節し、エンパグリフロジンが心臓の電気活動を調節する可能性があることを示唆しています。 エンパグリフロジンは、糖尿病の心臓においてイソプロテレノールによって誘発される心室不整脈を軽減することが示されている[59]。 エンパグリフロジンは、機能不全心筋細胞における Ca2+ スパーク頻度を減少させ、CaMKII 活性を弱めることが証明されています [40]。 したがって、我々のHFモデルでは、エンパグリフロジンは、酸化ストレスまたはCaMKII活性を低下させることにより、HFにおけるリン酸化リアノジン受容体によるSERCA機能不全またはカルシウム漏出を軽減することにより、イソプロテレノール誘発性心機能不全を軽減する可能性がある[3、40、60]。 イソプロテレノールは、臨床現場でのベータアドレナリン刺激を通じて心拍数を増加させます。 さらに、イソプロテレノールの長期治療は、β-1 アドレナリン作動性受容体を下方制御し、β-アドレナリン作動性受容体アゴニストの有効性の低下または喪失につながる可能性があります[61]。 イソプロテレノールは、HF 動物モデルの誘導に広く使用されています。 しかし、イソプロテレノールによるHF誘導後のHRの有意な増加は、異なる研究間で一貫していない[62、63]。 本研究では、健康な対照ラットとHFラットの間に有意な差がないことがわかりました。これはおそらくイソプロテレノール注射の頻度（1回のみ）と心拍数測定のタイミング（イソプロテレノール注射後6週間）に起因すると考えられます。

SGLT2iで治療されたDM患者は、より高いレベルのケトン(β-OHB)を示した[64、65]。 SGLT2i は脂肪分解を活性化し、インスリンレベルを低下させ、それにより肝臓でのケトン生成を促進します [66]。 β-OHB は、HF 患者の心拍出量と収縮機能も改善します [67]。 本研究では、エンパグリフロジンで治療したHFラットの方が、ビヒクルで治療したHFラットよりも左室収縮機能と血清β-OHB濃度が高いことを見出し、β-OHBがエンパグリフロジンの心臓保護効果に寄与している可能性があることを示唆した。

より重篤な心房線維症は、心房細動の発生率の上昇と関連している[68]。 エンパグリフロジンは糖尿病ラットの心室線維症を減少させた[69]。 本研究では、エンパグリフロジンがイソプロテレノール処置ラットの心房線維症を軽減したことにより、エンパグリフロジンが心房線維症を軽減することを発見しました。 臨床現場と相関させるために、我々は心房線維芽細胞を1μmol/Lエンパグリフロジン（複数回経口投与後の2型糖尿病患者の最大血漿エンパグリフロジン濃度と同様の濃度[70、71]）で治療した。 この発見は、ヒト心房線維芽細胞におけるエンパグリフロジンの抗線維形成効果の臨床的関連性を示した。 したがって、SGLT-2i は潜在的な治療戦略となる可能性があります。

この研究にはいくつかの制限がありました。 まず、圧力-体積ループ実験によれば、SGLT2i は糖尿病動物モデルにおける収縮終期および拡張終期の圧力-体積関係を改善しました[72]。 ただし、この研究ではこの実験は行われませんでした。 したがって、HF 心筋の活性化または弛緩挙動に対する SGLT2i の影響については明らかではありません。 さらに、対照細胞と比較して、心房線維芽細胞は、6 時間のエンパグリフロジン処理下で、NHE シグナル伝達を介してより低い細胞内 pH を示しました。 それにもかかわらず、エンパグリフロジンが心房線維芽細胞の細胞内pH調整に作用するのにどれくらいの時間がかかるかは依然として不明である。 さらに、この研究では、イソプロテレノール治療の6週間後に心室サイズと心機能を測定しました。 対照ラットとHFラットの間の同様の厚さは、心筋の喪失と代償性心室筋細胞肥大の最終的な結果に起因する可能性がある。 以前の研究では、高用量（170 mg/kg/日）のイソプロテレノールによって誘導された若い成体ウィスター HF ラットは、HF 誘導後 4 週間と 8 週間で同様の LV 後壁の厚さを有していたことが明らかになった [73]。 同様に、ウィスターラットにイソプロテレノール 85 または 170 mg/kg/日によって誘発された HF では、LV 質量の増加は 16 週間でのみ発生しましたが、HF 誘発後 2 週間または 6 週間では増加しませんでした [74]。 これらの所見は、イソプロテレノール誘発性 HF における心室肥大が用量と期間に依存する可能性があることを示唆しています。 したがって、イソプロテレノール治療後の期間が長くなると、LV 後壁の厚さに異なる影響が生じる可能性があります。 最後に、臨床シナリオを模倣するために、対照ラットの心臓に対するエンパグリフロジンの効果は測定しませんでした。また、健康な動物に対するエンパグリフロジンの効果はこの研究では解明されていません。 しかし、研究により、エンパグリフロジンは健康なラットの心線維症、心室壁の厚さ、駆出率には影響を及ぼさない可能性があることが明らかになった[75、76]。

結論として、図８に要約されるように、エンパグリフロジンは、ＮＨＥを阻害することにより、リン酸化ＰＬＣの発現およびＩＰ３産生を減少させ、それによって、ＥＲ Ｃａ２＋放出、細胞外Ｃａ２＋流入および心房線維芽細胞の線維化促進活性を減少させる。

心房線維芽細胞に対するエンパグリフロジンの抗線維化効果の根底にある提案された分子機構。 エンパグリフロジンは、Na+-H+ 交換体 (NHE) を阻害することにより、リン酸化ホスホリパーゼ C (PLC) の発現とイノシトール三リン酸 (IP3) の生成を減少させ、それにより ER Ca2+ 放出、細胞外 Ca2+ 流入を減少させ、心房線維芽細胞の線維化促進性細胞活性を減少させます。

この研究の結果を裏付けるデータは、合理的な要求に応じて対応著者から入手できます。

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著者らは、台北医科大学 (TMU) の Ca2+ 画像実験の中核施設によって提供される技術サービスを認めています。 著者らは、この動物研究に対する技術的支援について、TMU 実験動物センターに感謝します。

この研究は、台北医科大学万方病院 [108-wf-swf-06] および台湾科学技術省 (MOST 108-2314-B-038-117-MY3、MOST 111-2314-B) の支援を受けました。 -038-027-MY3)。

台北医科大学医学部内科循環器科（台湾、台北）

チェン・チー・チョン、ヨン・クオ・リン、イージェン・チェン

台湾、台北市の台北医科大学万芳病院内科循環器内科

チェン・チー・チョン、ヨン・クオ・リン、イージェン・チェン

台北医科大学台北心臓研究所、台北、台湾

チェン・チー・チョン、ヨン・クオ・リン、イージェン・チェン

台湾、台北、国防医療センター生体医工学部

ヤオ・チャン・チェン

台北医科大学医学部臨床医学大学院, No. 250, Wu-Hsing Street, 11031, Taipei, Taipei

カオ・ユーシュン & チェン・イージェン

台北医科大学万芳病院医学教育研究部（台湾、台北）

カオ・ユーシュン

台湾、桃園、長庚記念病院心臓病科

イェ・ヨンシン

台湾、桃園の長庚大学医科大学

イェ・ヨンシン

ベトナム、ハノイのバックマイ病院、放射線科センター

グエン・ゴック・チャン

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この研究は、C-CC、Y-HK、Y-JC によって概念化されました。 Y-KL、Y-CC、N-NT は細胞実験と動物実験を実施しました。 C-CCはY-HK、Y-HYとともにデータを収集し、原稿を作成しました。 Y-JC は研究全体を監督し、原稿をレビューして編集しました。 著者全員が最終原稿を読んで承認しました。

Yu-Hsun Kao または Yi-Jen Chen との通信。

すべてのヒト細胞材料は、台北医科大学の共同審査委員会によって承認されました (TMU-JIRB. No.:N202202048)。 すべての動物プロトコルは、地元の動物倫理審査委員会 (LAC-2021-0223) によって承認されました。

すべての著者を代表して、責任著者は利益相反が存在しないことを表明します。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

追加ファイル 1: 図 S1。 SGLT2 タンパク質はヒト心房線維芽細胞で発現されます。

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転載と許可

Chung, CC.、Lin, YK.、Chen, YC. 他。 エンパグリフロジンは、ナトリウム水素交換体の阻害とカルシウム恒常性の調節を通じて心臓の線維形成を抑制しました。 心臓血管糖尿病 22、27 (2023)。 https://doi.org/10.1186/s12933-023-01756-0

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受信日: 2022 年 8 月 12 日

受理日: 2023 年 1 月 26 日

公開日: 2023 年 2 月 6 日

DOI: https://doi.org/10.1186/s12933-023-01756-0

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