アガロースゲルマイクロカプセルにより、

Scientific Reports volume 12、記事番号: 17014 (2022) この記事を引用

4507 アクセス

30 オルトメトリック

メトリクスの詳細

アルギン酸ピコトレゾルコアとアガロースゲルシェルで構成される新しいタイプのアガロースゲルマイクロカプセル（AGM）は、高品質の単一細胞増幅細菌ゲノム DNA を取得するために開発されました。 AGM は、標準的な実験室設備のみを使用して、AGM の凝集を防ぐ、水と同等の密度の油を含む安定したエマルジョンとして簡単に調製できます。 大腸菌の純粋培養からの単一細胞、ヒト腸内細菌の 15 株を含む模擬コミュニティ、およびシロアリ腸内細菌コミュニティが AGM 内にカプセル化され、それらのゲノム DNA サンプルがチューブ内で大規模な並行増幅によって調製されました。 ゲノム配列決定では 2 回目の増幅は必要なく、ゲノムのグアニン - シトシン含有量に関係なく、マイクロリットルスケールで従来の増幅方法を使用して得られるものよりもはるかに高い平均ゲノム完全性が示されました。 AGM を使用した当社の新しい方法により、多くの研究者が単一細胞ゲノミクスを簡単かつ効果的に実行できるようになり、まだ培養されていない微生物のゲノム解析を加速できます。

微生物はさまざまな環境に遍在して分布しています。 それらは他の生物と関係していることが多く、生態系において重要な役割を果たしています。 しかし、微生物の多くは従来の方法では培養が難しく、未培養微生物と呼ばれています1。 過去 20 年にわたり、小サブユニット リボソーム RNA (SSU rRNA) 遺伝子のアンプリコン配列解析やメタゲノムのショットガン配列解析など、培養に依存しない方法を使用して広範に研究されてきました。 メタゲノミクスは、コード化された遺伝子レパートリーに基づいて微生物叢の生態学的および生理学的機能を研究するための強力なツールです。 メタゲノム断片をそれぞれの微生物分類学的アセンブリに計算的にビニングする最近の開発により、メタゲノミクスの有用性が強化されました 2,3。 しかし、配列組成、データベース配列との相同性、および各フラグメントの配列リードカバレッジに基づく計算によるビニングでは、密接に関連した (亜) 種のゲノムを識別したり、rRNA などの他のゲノム領域とは異なる特徴を示すゲノム領域を正しく分類したりできないことがよくあります。遺伝子、プロファージ、プラスミド4、5。 さらに、微生物群集の少数種のゲノム配列を取得するには、大規模な配列決定の取り組みが必要です3。

物理的に単離された単一細胞から全ゲノム DNA を増幅する単一細胞ゲノミクス 6 は、未培養の微生物の代謝能力を明らかにするための代替または補完的な方法として使用されています 1,7。 単一細胞の分離は、多くの場合、蛍光活性化セルソーティング (FACS)1、マイクロマニピュレーター 8、マイクロ流体デバイス 9,10、油中水滴へのカプセル化 11 などの技術を使用することで実現できます。 全ゲノム増幅のためのさまざまな方法が開発されていますが 12、ランダムプライマーを使用した phi29 DNA ポリメラーゼを使用する多重置換増幅 (MDA) が、その比較的単純さ、信頼性、および適用可能性により最も広く使用されています 6,13。 しかし、MDA は本質的にゲノム領域間で極端な増幅の偏りを示し 1、これが単細胞ゲノミクスにおける主な技術的制限となっています。 さらに、ゲノム DNA のグアニン - シトシン (GC) 含有量が高いと、増幅バイアスが増加する傾向があります 1,14。 増幅の偏りは、小さな反応容器を使用して抑制できます。 たとえば、マイクロチャネル チャンバー (60 nL)10、ナノリットル マイクロウェル (12 nL)15、仮想マイクロフルイディクス (ゲル シート内の MDA、60 nL)16、マイクロチャネル (9.5 ～ 240 pL) を使用して生成されるデジタル液滴 17、18、 １９およびゲルビーズ２０。 しかし、これらの微細加工技術は多くの微生物学者には利用できず、増幅産物の量は直接ゲノム配列決定するには少なすぎることがよくあります。 したがって、多くの場合、MDA の 2 回目のラウンドが必要となり、最終的に増幅バイアスが強化されます 21。

ヒドロゲルシェルとゾルコアからなる中空コアヒドロゲルマイクロカプセル22は、単細胞MDAの効率的な容器としての可能性を秘めています。 多くの中空コアヒドロゲルマイクロカプセルが細胞培養や細胞移植に有用であることが報告されています 23、24、25。 しかし、マイクロカプセル内のピコリットルスケールの中空コアで増幅された単一細胞ゲノム DNA からの MDA 産物は、単一細胞ゲノミクスに関して十分に評価されていません。

ここでは、アガロースゲルシェルとアルギン酸ゾル中空コアで構成されるAGMを使用した新しい単一細胞ゲノミクス手法を紹介します。これにより、単一細胞の分離とピコリットルスケールのMDAが可能になります（図1a）。 ここでは、AGM の製造は、ボルテックスミキサー、遠心分離機、市販の試薬などの安価な機器と試薬を使用して簡単に調製できるように最適化されています（図 1b）。ただし、AGM のサイズの均一性は、微細加工技術を使用する方法と比較して犠牲になります 26,27 。 したがって、この AGM は簡単に準備でき、多くの微生物学者にとって拡張可能です。 AGM を使用すると、単一の細菌細胞をピコリットルスケールのゾルコアにカプセル化し、溶液を交換するだけで MDA を行うことができます (ここでは「MDA-in-AGM」と呼ばれます)。 我々は、ヒトの腸内細菌とシロアリの腸内微生物叢の模擬混合物である大腸菌を用いて、MDA-in-AGM により、FACS とマイクロリットルを使用する従来の方法と比較してゲノム完全性が大幅に向上した大規模並列単一細胞ゲノミクスが可能になることを実証します。スケール MDA (FACS-MDA)。

アガロースゲルマイクロカプセル（AGM）とその調製プロセスの模式図。 (a) 単一細胞の分離と多重置換増幅 (MDA) のためにこの研究で開発された AGM の概略図。 AGM は、アガロース ハイドロゲル シェルとアルギン酸ゾル コアで構成されます。 アルギン酸コアはMDAのためのピコリットルスケールの反応チャンバーを提供し、アガロースシェルは酵素と小分子の透過性エンベロープとして、また細菌細胞やゲノム/増幅DNAなどのより大きな粒子や分子に対する保護壁として機能します。 (b) 大腸菌細胞を含む AGM の調製スキーム。 アルギン酸コアとアガロースシェルは、それぞれ CaCO3 からの Ca2+ でゲル化され、エマルジョン中で冷却されます。 オクタカプリル酸ポリグリセリル-6 (PGO) は、冷却することでアガロースゲル化中の AGM の凝集を抑制できます。 最後に、アルギン酸ゲルのコアは、Ca2+ をキレート化することによって EDTA でゾル化されます。 ISAイソステアリルアルコール。

AGM コアの場合、細菌細胞を含むアルギン酸ゲルビーズを乳化/内部ゲル化法 27 を使用して調製しました (図 1b)。 簡単に説明すると、アルギン酸塩溶液、細菌細胞、および CaCO3 ナノ粒子の混合物をイソステアリル アルコール (ISA) で乳化しました。 得られた微小液滴は、油中水型エマルジョンに酢酸を添加することによって CaCO3 ナノ粒子から放出されたカルシウムイオンでゲル化しました。 細菌細胞の濃度は、1 つのアルギン酸微液滴に 1 つの細菌細​​胞が含まれるか、まったく含まれないように段階希釈を使用して最適化されました。 得られたアルギン酸ゲルコアをジエチルエーテル、1-ブタノール、トリス-HCl (pH 7.5) 緩衝液で順次洗浄しました。

次に、アガロース溶液 (SeaPlaque、Lonza、最終濃度 2%) を、35 °C で Tris-HCl (pH 7.5) に懸濁したアルギン酸ゲルコアに添加し、混合物を 0.25% (v/v) Span 85 in で乳化しました。 35 °C でのオクタカプリル酸ポリグリセリル-6 (PGO) (図 1b)。 ここで PGO を使用したのは、その密度が水と同等 (0.997 g/mL) であるため、PGO は水を安定して乳化し (補足​​図 S1a)、アガロースゲルの凝集 (S1b) を防ぎ、直径 (S1c および S1d) と収量を増加させました。 (S1e) アガロースゲル液滴。 アガロース液滴は、4 °C で冷却することにより、安定なエマルジョン中で徐々にゲル化しました。 ジエチルエーテルと混合し、さらに１－ブタノールと混合することによってＰＧＯを除去した後、アルギン酸ゲルコアを１０分の１容量の０．５Ｍエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）で単離した。 アルギン酸コアのゾル化は、アルギン酸コアをローダミン 123 で標識し、EDTA の存在下でアガロースゲルシェルを融解するときの緩衝液への色素の拡散を観察することによって検証されましたが、アルギン酸コアは 50 mM CaCl2 でゲルの形のままでした（補足）図S2)。 アルギン酸ゾルコアは、MDA反応に適切な空間を提供します。これは、後述するアルギン酸ゲルコアまたはアガロースゲルビーズを用いた反応よりもはるかに高い増幅DNA収量によって示されました。 AGM を Tris-EDTA (TE) 緩衝液 (pH 7.4) で洗浄して過剰な EDTA を除去し、半分の容量の TE 緩衝液に懸濁し、4 °C で保存しました。 AGM 準備の全プロセスは 7 時間で完了できます。

モデル微生物としては大腸菌ＤＨ５αを用いた。 大腸菌細胞を 3 × 106 細胞 mL-1 の濃度でアルギン酸 CaCO3 溶液に添加し、3 回の独立した実験で 5.64 ± 1.72 × 105 AGM (平均 ± SD) にカプセル化しました。これは 12.5% ± 5.4% に相当しました。株主総会全体のうち。 大腸菌細胞を含む AGM のうち、約 94% がコアに単一細胞を保有していました (補足表 S1)。 3 つの独立した実験では、準備された AGM の直径は 39.6 ± 22.2 μm、51.4 ± 13.3 μm、および 49.3 ± 19.6 μm でした（補足図 S3a）。 AGM の直径とコア体積は、それぞれ正規分布と対数正規分布を示しました（補足図S3b、S4）。 3 回の実験における AGM コア体積の平均中央値は 15.1 ± 6.3 pL (n = 3) でした。

AGM (50 μL 懸濁液中) を滅菌水で洗浄し、遠心分離によって収集しました。 細菌細胞の溶解とAGM内の二本鎖DNAの変性は、REPLI-g UltraFast Mini Kit (Qiagen)の緩衝液D2であるアルカリ溶液50μLを用いて室温で30分間実行されました。 キットからの等量の停止溶液を加えて中和することによって変性を停止し、その後、上清を遠心分離によって除去した。 キットの REPLI-g UltraFast DNA ポリメラーゼ 11 μL を含む反応バッファー (93.5 μL) を加え、得られた混合物を 30 °C で 3 時間インキュベートしました。 反応を10分の1量の0.5M EDTAで停止し、AGMを200μLのTE緩衝液で3回洗浄した。 MDA および AGM 調製物で使用されるすべての試薬は、使用前に汚染 DNA を分解するために紫外線を照射されました。

大腸菌細胞で調製された4.6±2.9×105のAGMのうち、8.9％±0.8％がDNA増幅を示し、これは大腸菌細胞を含むAGMの77.0％±27.2％に相当しました（n = 3）（補足表S1） 。 図2に示すように、増幅されたDNAはアルギン酸ゾルコアを満たしていましたが、EDTAによるゾル化ステップなしで調製されたアルギン酸ゲルコアを含むAGM、またはアルギン酸コアを含まないアガロースゲルビーズは、MDAによるDNA増幅が限られているか、まったく示されませんでした。

アルギネートコアゾル化による多重変位増幅（MDA）の収率の向上。 アガロースゲルマイクロカプセル (AGM) 内の MDA の生産性に対するアルギン酸コアゾル化の影響を評価しました。 AGM 内にカプセル化された大腸菌のゲノム DNA は、EDTA を使用したアルギン酸塩ゾル化の有無にかかわらず、MDA によって増幅されました。 増幅された DNA は SYBR Green I で検出されました。位相コントラスト画像 (赤) と落射蛍光画像 (緑、SYBR Green I) が重ねられています。 油エマルション中の大腸菌を含むアガロース液滴のゲル化を使用して調製したアガロースゲルビーズ中のMDA（アルギン酸コアなし）も、対照実験として実施した。 矢印は、SYBR Green I で染色された大腸菌細胞を示します。バー = 100 μm。

MDA-in-AGM を使用した単一細胞増幅ゲノム (SAG) の品質を評価し、FACS-MDA によって得られたものと比較しました。 SYBR Green I で染色された増幅 DNA を含む AGM を、TransferMan NK2 マイクロマニピュレーター (Eppendorf) を備えた落射蛍光顕微鏡下で、29 μL の滅菌水とともに 0.2 mL PCR チューブに個別に移しました。これには、AGM あたり約 5 分を要しました。 初期コストが低いため、この研究ではマイクロマニピュレーターが使用されました。 選ばれた数十の株主総会は次のように順序付けされました。 AGM 内の増幅された DNA は、チューブを 60 °C で 5 分間加熱することによって水中に放出され、QIAseq FX DNA ライブラリー キット (Qiagen) を使用したシーケンシング ライブラリーの調製に直接使用されました。 ゲノム配列決定に適したライブラリーを取得するために、MDA の 2 回目のラウンドは必要ありませんでした。 ペアエンドシーケンスリードは、Illumina MiSeq プラットフォームで Reagent Kit V3 (600 サイクル) を使用して生成され、固定数のリードペアがランダムに選択され、標準品質のフィルター処理後に SPAdes 3.13.028 を使用してコンティグに新たに組み立てられました。 1 kbを超えるコンティグをその後の分析に使用しました。 完全性や混入率など、ゲノム配列の品質を記述するいくつかの要素が CheckM29 および QUAST30 を使用して評価され、MDA-in-AGM と FACS-MDA を使用して得られた SAG 間で比較されました。

MDA-in-AGM によって得られた大腸菌 SAG のゲノム完全性と総配列長は、配列決定作業中に急速に増加し、60 倍のカバレッジを使用したアセンブリの平均ゲノム完全性は 93.3% ± 4.1% (n = 10) に達しました。 、一方、FACS-MDAでは33.7％±17.3％（n = 10）でした（スチューデントのt検定、P <0.01）（図3a、補足表S2）。 リードを参照大腸菌 DH5α ゲノム配列 (BOCF01000000) にマッピングすることによって計算された対象ゲノムは、MDA-in-AGM (n = 10) で 97.4 ± 2.1% であり、FACS-MDA の 47.8% ± 13.5% よりもはるかに高かった60 倍カバレッジ読み取りの場合 (n = 10) (P < 0.01) (補足表 S2)。 配列決定作業の深さに沿ったMDA-in-AGMにおけるコンティグ数の急激な減少、すなわちコンティグのスムーズな組み立ては、おそらく増幅バイアスが低いためであった(図3a)。 さらに、MDAに固有のゲノム領域間の増幅バイアスは、FACS-MDAと比較してMDA-in-AGMでは大幅に改善されました（図3b）。 SAG の増幅バイアスは、母集団の格差を指標とプロットとして示すジニ係数とローレンツ曲線を使用してさらに評価されました。 MDA-in-AGM によって得られた SAG のジニ係数は、FACS-MDA のジニ係数よりもはるかに低く (ウェルチの t 検定、 P < 0.01)、FACS-MDA よりも MDA-in-AGM の均一性が高いことを示しています (補足図) .S5a)。 ローレンツ曲線では、MDA-in-AGM によって得られた SAG は、FACS-MDA によるものよりも高い増幅均一性を示しました（補足図 S5b）。 すべてのシーケンスリードを使用した SAG のその他の品質メトリクスを補足表 S3 に示します。

MDA-in-AGM および FACS-MDA によって得られた単一細胞ゲノムのゲノム完全性と増幅バイアスの比較。 (a) シーケンスプロセス中の SAG の完全性とコンティグの数。 ヒト腸内細菌の模擬コミュニティからの例として、大腸菌および 2 つの細菌種のボックスアンドバイオリン プロット (青: AGM 内の MDA、赤: FACS-MDA) を示します (補足表 S2、S5、および S6)。 データポイント (紫色の円) とその算術平均 (ひし形) がプロット上に表示されます。 大腸菌のグラフでは、MDA を使用せずに培養大腸菌細胞から調製した DNA の結果も示されています (緑の丸)。 左側のパネルでは、有意差をアスタリスク (P < 0.05) または二重アスタリスク (P < 0.01) で示します。 (b) ゲノム領域に対してマッピングされたシーケンスリードの数は、MDA 中に引き起こされる増幅バイアスの指標として示されています。 de novo アセンブリに使用されたさまざまなカバレッジに対応するリード数 (「Cov.」として表示) と CheckM を使用して推定されたゲノム完全性 (%) (「Compl.」) が表示されます。

より現実的なサンプルにおける MDA-in-AGM の実現可能性を評価するために、ヒト腸内細菌の 15 培養株からなる模擬コミュニティを構築しました。 16S rRNAアンプリコン分析またはメタゲノム分析を使用して推定された各細菌株の分類と組成を補足表S4に示します。 モック コミュニティからの SAG は、上記と同じ方法で MDA-in-AGM または FACS-MDA を使用して取得しました。 SAG の分類学的組成は、MDA-in-AGM と FACS-MDA の間で類似しており、どちらも、Faecalibacterium prausnitzii を除いて、モックコミュニティの > 5% を占めるほとんどの菌株の SAG を回収することに成功しました (補足表 S4)。 たとえば、バクテロイデス シータイオタオーミクロンとパラバクテロイデス ディスタソニスのSAGは、大腸菌SAGで見られるように、ゲノムの完全性、コンティグの数、および増幅バイアスにおいてMDA-in-AGMとFACS-MDAの間に明らかな違いを示しました（図3、補足図） .S5)。 環境サンプルから得られた多くの SAG は参照ゲノムがないため同じカバレッジで比較することが困難であるため、以下の実験では 0.3 M リードペアを使用してモック SAG を組み立てました。 汚染度が 5% 未満の SAG の全体的なゲノム完全性は、FACS-MDA (42.4% ± 20.5%、n = 36) よりも MDA-in-AGM (68.0% ± 23.3%、n = 39) の方が有意に高かった (P < 0.01) (補足表 S5、S6)。 他のほとんどの株のSAGも大腸菌SAGと同様の結果を示しました（補足図S6）。

ほとんどの配列リードはそれぞれの参照ゲノムにマッピングされました。マッピング率の中央値は、MDA-in-AGM および FACS-MDA からの SAG でそれぞれ 95.1% と 97.6% でした (補足表 S7)。 相互汚染率はFACS-MDAよりもMDA-in-AGMの方がわずかに高かったが、どちらも5％未満であった（補足表S7）。 バで。 シータイオタオーミクロン SAG、Ba からの配列読み取り。 シータイオタオーミクロンプラスミドも得られました（補足表S7）。 我々の結果は、MDA-in-AGM がさまざまな細菌種に適用可能であり、GC 含量に関係なく、グラム陽性菌とグラム陰性菌の両方のゲノム完全性を向上させることを示しました (図 4)。 ファにとっては。 prausnitzii 氏によると、KOH を使用した細胞溶解プロセスが効果的ではなかったため、MDA-in-AGM または FACS-MDA のいずれでも SAG が得られなかった可能性があります。

ヒト腸内細菌の模擬コミュニティにおけるゲノムの完全性と単細胞ゲノムの GC 内容との関係。 15 株のヒト腸内細菌を含む模擬コミュニティからの単細胞増幅ゲノム (SAG) を、ゲノムの完全性に対して GC 含量とともにプロットします。 SAG はランダムに選択された 0.3 M リード ペアから組み立てられましたが、MDA-in-AGM の MS485-1-51 (0.26 M リード ペア) と FACS-MDA の CS1 ～ 94 (0.29 M リード ペア) はすべてのリード ペアを使用しました。モックコミュニティを構成する細菌種と詳細な結果を補足表S4〜S6に示します。 青と赤はそれぞれ MDA-in-AGM と FACS-MDA を示します。 四角、丸、ひし形はそれぞれグラム陽性菌、グラム陰性菌、グラム変性菌を示します。

細胞外 DNA の汚染、または単一の AGM にカプセル化された複数の細胞のいずれかによって引き起こされる、5% を超える汚染を伴う MDA-in-AGM 由来の SAG は、metaWRAP31 を使用して各細菌種にビン化されました。複数の細胞を捕捉するのは困難でした。 その結果、汚染率が 5% 未満の追加の 30 個の SAG が得られ、それらのゲノム完全性と汚染率はそれぞれ 73.5% (中央値) と 0.9% (中央値) でした (補足表 S8)。

MDA 中の DNA 再構成、つまりキメラの形成は、単細胞ゲノムの de novo アセンブリを複雑にする可能性があります 32。 大腸菌 SAG では、キメラ読み取り率は、FACS-MDA (4.49% ± 1.32%) よりも MDA-in-AGM (6.28% ± 1.09%) の方がわずかに高かった (Welch の t 検定、P < 0.01; 補足表) S3)。 モックコミュニティからの SAG では、キメラ読み取り率は、FACS-MDA (3.55% ± 1.07%) よりも MDA-in-AGM (8.22% ± 2.28%) の方が高かった (Welch の t 検定、P < 0.01; 補足表) S5、S6）。 MDA-in-AGM におけるこれらのキメラリード率は、ヒト半数体ゲノムの配列決定に従来の MDA 法を使用した以前の研究における 6.19% の率と同等か、わずかに高かった 33。

最後に、MDA-in-AGM を自然環境サンプルに適用しました。 我々は、多様な門からの数百の細菌種で構成されるシロアリ Reticulitermes speratus の腸内の微生物叢を使用しました 34。 シロアリの腸内微生物叢は、特に高効率の植物バイオマス分解を可能にする複雑な共生システムのために研究者を魅了しています 35,36,37。 シロアリの腸内細菌叢は、その細菌群集の構造がシロアリ種内で非常に一貫しており、よく特徴付けられており 34,36,38,39 、さらに優勢なシロアリの完全なゲノム配列がわかっているため、自然環境サンプルを使用したベンチマーク研究にも優れています。 R. speratus の腸内の細菌種が報告されています40、41、42。

5 匹の働きシロアリの腸全体が除去され、腸の内容物が懸濁されました。 次に、細胞外 DNA を DNase I で消化した後、18,000 xg で 5 分間の遠心分離により細菌細胞を収集し、前述のように細胞を滅菌水で洗浄しました 43。 以降の手順は上記と同様である。 シロアリの腸からの環境標本を使用して MDA-in-AGM を評価するために、MDA-in-AGM によって得られた 48 個の SAG を分析しました。 SAG は、高いゲノム完全性 (78.6% ± 18.2%) と低い汚染率 (1.0% ± 1.0%) を示しました (表 1)。 SAG は、ゲノム分類データベース ツール キット (GTDB-Tk)44 を使用して分類学的に分類され、シロアリ腸内の既知の優勢グループ、スピロヘチア、バクテロイディア、アルファプロテオバクテリア、ベータプロテオバクテリア、デルタプロテオバクテリア、イプシロンプロテオバクテリア、クロストリジウムを含む 13 の細菌クラスに関連付けられていました 34,38。 。 対照的に、FACS-MDA によって得られた SAG のゲノム完全性は、わずか 37.7% ± 19.0% (n = 161) でした。 後者の場合には、別のシーケンス法、つまり Nextera XT DNA Library Prep Kit (Illumina) と Illumina HiSeq 2500 プラットフォーム (500 サイクル) の組み合わせが使用されましたが、アセンブリに使用されたリード (塩基) の数は非常に多くなりました。 MDA-in-AGM によって得られた SAG の分析 (256 Mb ± 49 Mb、n = 48) よりも平均で大きい (551 Mb ± 64 Mb、n = 161) (補足表 S9)。

48 個の SAG に加えて、MDA-in-AGM によって取得された小さなゲノム サイズ (約 1 Mb)40 を持つエンドミクロビア クラスの 18 個の SAG を分析し、91.2% ± 9.8% のゲノム完全性が得られました。 さらに、それらのうち、系統型 Rs-D17 の 8 つの SAG が、以前に得られた完全なゲノム配列と比較されました 40,41。 Rs-D17 の 2 つのゲノモ変種 (Ri200840 および Ti200541) に読み取りをマッピングすることによって計算されたゲノム カバレッジは、それぞれ 95.7% ± 1.3% および 96.7% ± 0.9% に達しました (補足表 S10)。 シロアリの消化管コミュニティの組成は、MDA-in-AGM または 16S rRNA アンプリコン分析によって得られた SAG から推定されました (補足表 S11)。 SAG の分類学的組成は、16S rRNA アンプリコン分析で示されたものと高い正の相関 (R = 0.834、P < 0.01; ピアソンの相関係数) を示しましたが、グラム陽性細菌の頻度は SAG で低かったです。

MDA-in-AGM は、ピコリットルスケールの AGM コア内の大規模な並列 MDA で構成され、従来のものと比較して、ヒトの腸内細菌の模擬コミュニティである大腸菌およびシロアリの腸内の細菌の SAG のゲノム完全性が大幅に向上しました。マイクロリットルスケールのFACS-MDA。 それらの中で、MDA-in-AGM を使用してシロアリの腸内細菌から得られた高被覆率の SAG (表 1、補足表 S9) は、複雑な腸内共生システムと高効率のリグノセルロース分解システムのメカニズムの理解を促進します 34。 36、40、41、43。 したがって、この方法は、動物の腸管、土壌、水圏などの環境におけるまだ培養されていない原核生物の代謝能力を明らかにすることができます。

微細加工技術を使用して MDA の反応量を削減することにより、単一細胞ゲノム解析におけるゲノム完全性が向上することは以前に報告されています 10、15、17、20、45。MDA-in-AGM と他の MDA 手法との比較を以下に示します。補足表S12。 他の小型 MDA メソッドを使用しても高いゲノム完全性が達成されますが、MDA-in-AGM は特殊な機器を必要とせず、拡張可能なサンプル前処理を提供します。 さらに、アルギン酸ゾルコアの使用により MDA の収率が向上し、2 回目の MDA ステップが不要になり 20,45、増幅バイアスが減少し、ワークフローが簡素化されました。 この高い収率は、おそらくゾルコア内で増幅された DNA の拡散性が向上したことに起因すると考えられます 46。 当社の MDA-in-AGM は、グラム陽性菌とグラム陰性菌の両方に適用でき、GC 含量の高いゲノムにも適用できます (図 4)。 AGM のさらなる利点は、その物理的安定性と小分子に対する透過性であり、これによりバッファー交換と物理的取り扱いが非常に容易になります。

MDA 中のキメラ配列の形成は、SAG の de novo アセンブリの効率と精度に影響を与える可能性があります 47。 モックコミュニティでは、キメラ読み取り率は液滴 MDA19 の読み取り率と同等であり、従来の MDA 法よりもわずかに高かった (補足表 S12)33。 キメラの形成は増幅された DNA の分岐移動に起因すると考えられるため 32、熱安定性 phi29 DNA ポリメラーゼ 14 を使用して MDA 反応温度を高くすると、レプリコン間の誤ったハイブリダイゼーションが減少する可能性があります。

MDA反応量に対応するアルギネートコアサイズの均一性（補足表S1）は、DNA増幅AGMの収量、MDA生成物の量の均一性、およびAGMライブラリーの品質に影響を与えた可能性があります。 AGM 調製には直径 100 μm 未満のアルギン酸塩コアが使用されていましたが、アルギン酸塩コアのサイズをより狭く選択する (たとえば、直径 20 ～ 40 μm) と、AGM コアの均一性が向上します。 押出成形 48 およびマイクロチャネル 17、18、19 も、サイズを選択せず​​に AGM コアの均一性を向上させる可能性があります。 しかし、これらのプロセスを導入すると、ワークフローが複雑になり、コストが増加します。

マイクロマニピュレーターを使用した手動ピッキング手順は、MDA-in-AGM を使用した単一細胞ゲノミクスの律速ステップです。 スループットを向上させるために、FACS または SAG の分子バーコーディング 49 を使用した AGM ソーティングを適用することができますが、これらのアプローチは現在のプロトコルの単純さと安価さも低下させます。

MDA-in-AGM によって得られた SAG の分類学的組成は、16S rRNA アンプリコンおよびメタゲノム解析によって示されたものとほぼ一致していました。 ただし、支配的な Fa の SAG です。 prausnitzii は、MDA-in-AGM または FACS-MDA のいずれでも回収されませんでした (補足表 S4)。 したがって、この失敗は AGM 内の MDA に特有のものではなく、MDA 手順に起因するものでした。 分類学的組成における同様の矛盾が、シロアリの腸内細菌叢を使用した実験のグラム陽性菌クラスでも見られたため（補足表S11）、そのため、特定のグラム陽性菌については、リゾチームの添加を含む細胞溶解手順の修正が必要になる可能性があります。 私たちはまだ試みていませんが、サイズ 4 nm50 のリゾチームは、2% 低融点アガロース (孔径 200 nm) からなるアガロースゲルシェルを通って拡散し 51、コア内の細菌細胞壁を溶解します。 このような条件を最適化するには、他の方法に比べて溶液の交換が容易なAGM法も優れています。

大腸菌 (93%) と比較して、模擬コミュニティ (68%) およびシロアリ腸内微生物叢 (79%) の平均ゲノム完全性が低いのは (補足表 S2、S5、表 1)、細胞溶解の容易さ。 培養大腸菌の SAG と比較して、特定の細菌系統および環境サンプルにおける SAG のゲノム完全性が低いことが、MDA 法に関係なく、以前の研究で報告されています 1,52。 例えば、液滴単細胞 MDA では、大腸菌と土壌微生物叢のゲノム完全性は、それぞれ 96.5% ± 2.2% (n = 16) と 52.8% ± 24.3% (n = 17) であることが判明しています19。 さまざまな原核生物株や環境サンプルに対する細胞溶解の最適化も、ゲノムの完全性を高めるために重要です。

最近、私たちの実験が進行中に、架橋PEGゲルシェルとデキストランゾルコア、AGM46に似たカプセル構造からなる中空コアヒドロゲルマイクロカプセルを使用したMDAを示すレポートが発表されました。 増幅バイアスは評価されていませんが、コア内の単一細胞 MDA は、ゲルビーズ内の MDA と比較して MDA 生成物の量を増加させます。 さらに、中空コアのヒドロゲルマイクロカプセルのシェルは、MDA 前のアルカリ変性後にゲノム DNA がコアから漏れるのを防ぎます。 しかし、PEG シェルの光化学架橋に使用される近紫外光 (365 nm) は、光酸化により細胞と DNA に損傷を与えます 53。 アガロースは熱的に穏やかな可逆的ゲル化を可能にし、市販されており、MDA 試薬、特にアルカリ溶液、中和緩衝液、EDTA の存在下で安定であるため、AGM シェルとしてアガロースを選択しました。

単一の細菌細胞を含む AGM またはその他の反応チャンバーでは、必然的に複数の細菌細胞を含むチャンバーの一部が生成され 21、以前に開発された他の方法と同様に、我々の実験手順で汚染 DNA を完全に除去することは困難です 1。 それにもかかわらず、metaWRAP31などのメタゲノム断片をビニングするためのコンピュータープログラムを適用すると、汚染配列を排除することにより、複数の細胞に由来するミニメタゲノムビンから少なくとも品質中央値のかなりの数のSAGを回収することができました（補足表S8）。 。

近年、環境サンプルからメタゲノムで構築されたゲノムを分析する多くの研究が報告されています54。 単一細胞ゲノミクスにはさまざまな利点があり、メタゲノミクスと組み合わせることで、たとえば株レベルの不均一性 55 を明らかにしたり、水平伝達された遺伝成分に関する情報を提供したり 45 するなど、研究の質を向上させる可能性がありますが、多くの微生物学者にとってこれを実行することは困難です。 MDA-in-AGM は、単一細胞ゲノミクスのより簡単で安価な方法であり、さらに少量のサンプルしか必要としません。 したがって、この方法は、小さな昆虫の腸管や、内部および外部共生細菌群集を持つ原生生物細胞などの小さな標本にも適しています。

社内で調製したすべての溶液には、超高純度 DNase/RNase フリー蒸留水 (Thermo Fisher Scientific、マサチューセッツ州ウォルサム) を使用しました。 溶液を 121 °C で 15 分間オートクレーブ処理し、さらに層流キャビネット内で 7.2 mW/cm2 の UV 照射により一晩 (12 時間) 除染しました。

均一な CaCO3 ナノ粒子の懸濁液 (9.4% w/v、直径 100 nm、pH 10) は、白石中央研究所 (兵庫県) から提供されました。 CaCO3 懸濁液の導電率と pH は、3 倍量の水で粒子を洗浄することによって低下しました。 白石氏の CaCO3 に加えて、沈降炭酸カルシウム BioUltra (直径約 3 μm、Sigma、セントルイス、ミズーリ州) などの微細炭酸カルシウムもアルギン酸コアのゲル化に使用されました。 アルギン酸ナトリウム（1%、w/v で 80 ～ 120 cP、和光市、大阪、日本）を水に溶解することによってアルギン酸溶液（5%、w/v）を調製し、4 °C で保存しました。 アガロース溶液は、SeaPlaque (最終 2%、w/v; Lonza、バーゼル、スイス) を水に溶解することによって調製し、4 °C で保存しました。 オクタカプリル酸ポリグリセリル-6 (PGO; 日清オイリオ、東京、日本)、Tris-EDTA 緩衝液 (TE; 分子生物学用 BioUltra、pH 7.4; Sigma)、および REPLI-g UltraFast Mini Kit (Qiagen、ヒルデン、ドイツ) を使用しました。以下で説明します。

アガロース溶液 (2 mL) に、それぞれ 0.25% モノオレイン酸ソルビタン (Span 85; Wako) (v/v) を含む PGO または ISA (20 mL、35 ℃) を加え、ボルテックスして混合し、氷上でゲル化させた後、アガロースビーズを作製した以下に説明するように、PGO または ISA から回収されました。 300 µm セル ストレーナー (pluriSelect、ライプツィヒ、ドイツ) を使用して、大きなアガロース凝集体をアガロース ビーズから除去しました。 アガロースビーズは、CCD カメラ (BU-51LN; Bitran、埼玉、日本) を備えた倒立蛍光顕微鏡 (IX71; オリンパス、東京、日本) で観察されました。 画像上の 1 ピクセル上のアガロース ビーズの直径 (1.28 μm) を ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) で測定しました。 アガロースビーズの収量と直径は、R (https://www.r-project.org/) を使用して統計的に分析されました。

LB プレート上の単一コロニーからの大腸菌 DH5α (TaKaRa Bio Inc.、滋賀県、日本) を LB 培地 (200 mL) を含む 2 つのフラスコで培養しました。 次いで、大腸菌細胞を回収し、遠心分離によりＰＢＳ（２０ｍＬ）中で２回洗浄した。 細胞を PBS (10 mL) に再懸濁し、細胞計数チャンバーを使用して密度を測定しました。 大腸菌細胞 (3.05 × 1010 細胞/mL) をマイクロチューブ (各 0.5 mL) に分割し、-80 °C で保存しました。 下記のように、大腸菌の単一細胞、モックサンプル、およびシロアリ腸内マイクロバイオームは、-80 °C で保存された細胞、-80 °C で保存されたグリセロールストックの混合物、およびシロアリ腸からの生きた標本を使用して分析されました。それぞれ。

大腸菌細胞は、乳化/内部ゲル化法 27 によってアルギン酸コアにカプセル化されました (図 1b)。 ストック培養からの大腸菌細胞 (10 μL) を、1% CaCO3 および 50 mM 酢酸緩衝液 (pH 7.0、Sigma) を含む 2% アルギン酸ナトリウム溶液 990 μL と混合しました。 混合物を、５０ｍＬチューブ中で３％レシチン（Ｗａｋｏ）を含有するイソステアリルアルコール（ＩＳＡ；高級アルコール工業株式会社、千葉、日本）９ｍＬとともに、１分間ボルテックスすることによって乳化させた。 このエマルションを、ＩＳＡ中の２％酢酸（各０．１ｍＬ）と、それぞれ１分間１０回ボルテックスすることによって混合した。 この手順中に、混合物の pH は徐々に 4.0 まで低下し、CaCO3 ナノ粒子は溶解しました。 CaCO3 から放出されたカルシウムイオンは、エマルジョン中のアルギン酸塩の微小液滴をゲル化しました。 ISAを、9mLのジエチルエーテルと混合し、スイングローター(3000×g、5702R、エッペンドルフ、ハンブルク、ドイツ)を使用して4℃で3分間遠心分離することによって除去した。 0.2% (v/v) Tween 20 (Tris-Tween 20) (5 mL) を含む 50 mM Tris-HCl 緩衝液 (pH 7.5) と混合し、遠心分離して、残留 ISA をアルギネートコアからさらに除去しました。 1-ブタノール (5 mL) を使用してこの手順を 2 回繰り返します。 得られたアルギン酸コアを 1 倍量の 50 mM Tris-HCl (pH 7.5) に懸濁し、100 µm セル ストレーナー (pluriSelect) で濾過して、大きなアルギン酸凝集体を除去しました。 ろ過したアルギン酸コアを Tris-HCl (pH 7.5) でさらに洗浄し、2 mL マイクロチューブに収集しました。 アルギン酸塩コアの体積はその重量から計算され、半分の体積の Tris-HCl (pH 7.5) と混合した後 4 °C で保存されました。 単一アルギネートコア内の大腸菌細胞数を 2 未満に調整するために、大腸菌ストックからの 3.05 × 106 ～ 108 個の大腸菌細胞 10 μL を、CaCO3 を含むアルギネート懸濁液 990 μL と混合しました。 大腸菌を含むアルギン酸塩コアを混合物から調製した後、SYBR Green I（タカラバイオ株式会社）を使用してアルギン酸塩コア内の大腸菌を観察した（補足図S7）。 3.05 × 106 細胞/mL のアルギン酸塩混合物では、コアの 17.6% に大腸菌が含まれ、それらの 78.8% には単一細胞が含まれていました。 したがって、その後の実験ではアルギン酸コアの調製に 3.05 × 106 細胞/mL の大腸菌を使用しました。

アルギン酸コア懸濁液の上清 (600 μL) を 50 mL チューブ中で遠心分離後に除去しました。 残りのアルギン酸コア (400 μL) を、上記で調製したアガロース溶液 (2 mL) と混合しました。 混合物を 0.25% (v/v) Span 85 を含む PGO (20 mL) で 1 分間ボルテックスすることにより乳化させました (図 1b)。 アルギン酸コア、アガロース溶液、および PGO を 35 °C で 10 分間プレインキュベートして、ゲル化した大きなアガロース凝集体の形成を防止しました。 次に、アガロースを氷上で 1 時間冷却することによりゲル化させました。 ＰＧＯは、上記のように洗浄することによってエマルジョンから除去された。 アルギン酸ゲルコアは、1/10容量の0.5M EDTA(Thermo Fisher Scientific)を添加してカルシウムイオンをキレート化することにより単離した。 次に、AGM を 1 倍量の TE バッファーに懸濁しました。 懸濁液中の大きな破片を 300 µm セル ストレーナーを通して除去し、AGM を TE でさらに洗浄しました。 AGM を 0.5% SeaPlaque アガロース、0.1% p-フェニレンジアミン (Wako)、および 10,000 倍希釈 SYBR Green I (TaKaRa Bio Inc.) を含む 50 mM Tris-HCl (pH 7.5) で希釈し、形態、密度を測定しました。カプセル化された大腸菌細胞の、直径、および数を上記のように観察した。 AGM は 4 °C で保存されました。 長期保存 (1 週間以上) の場合、AGM は 40% エタノール中で -80 °C で保存され、使用前に 10 倍量の水で 3 回洗浄されました。 40% EtOH に保存された AGM のゲノム DNA の品質は、MDA を使用した増幅によって確認されました。

大腸菌を含まないアルギン酸ゲルコアを、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル) カルボジイミド塩酸塩 (東京化成工業株式会社、TCI、東京、日本) および N-ヒドロキシスクシンイミド (日本) を使用してローダミン 123 (Wako) で標識しました。わこ）56． ローダミン 123 標識コアを含む AGM を、50 mM EDTA または 50 mM CaCl2 の存在下、65 °C で 5 分間加熱しました。 上述のように、残留コアが観察された。

アルギネートコアをゾル化する前の大腸菌細胞を含む AGM のアリコート (50 μL) を、10 mM EDTA を含むまたは含まない 400 mM KOH を含む 1 容量の細胞溶解溶液と混合し、それらを 10 mM の停止バッファー 100 μL で中和しました。 REPLI-g UltraFast ミニキット。 大腸菌を含むAGM、大腸菌を含まないAGM（ネガティブコントロール）、および大腸菌を含むアガロースビーズ（コントロール）を以下のようにMDAに供し、増幅されたDNAを観察した。

AGM の 50 μL アリコートを遠心分離し、収集した AGM を 200 μL 水で洗浄しました。 細胞溶解および DNA 変性は、REPLI-g UltraFast Mini Kit のバッファー D2 (50 μL) を使用して室温で 30 分間実行されました。 Stop Buffer (50 μL) で変性を止めた後、遠心分離により上清を除去した。 キットの phi29 DNA ポリメラーゼ 11 μL を含む反応バッファー (93.5 μL) を加え、30 °C で 3 時間インキュベートしました (MDA-in-AGM)。 反応を1/10量の0.5M EDTAで停止させ、AGMを200μLのTEバッファーで3回洗浄した。 洗浄した AGM は 4 °C で保管されました。

MoFlo XDP 蛍光活性化セルソーター (Beckman Coulter Inc.、ブレア、カリフォルニア州) を使用した単一細胞 MDA をコントロールとして実行しました 43。 大腸菌の後、模擬細菌群集とシロアリ腸内細菌をSYBR Green IまたはCellTracker Green (Thermo Fisher Scientific)で染色し、染色された細菌を96ウェルPCRプレートのウェルごとに単一細胞に分類しました。 細胞溶解は、REPLI-g UltraFast Mini Kit の Buffer D2 (1.5 μL) を使用して室温で 30 分間実行されました。 停止バッファー (1.5 µL) で変性を停止した後、キットの phi29 DNA ポリメラーゼ 0.5 µL を含む反応バッファー (7.5 µL) を加え、30 °C で 3 時間、65 °C で 15 分間インキュベートしました。 ゲノム増幅と汚染の程度をチェックするために、16S rRNA の直接サンガー配列決定によって MDA 製品を評価しました。 PCR は細菌ユニバーサル 16S rRNA 遺伝子プライマー: 27F (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG) および 1390R (5'-ACGGGCGGTGTGTACAA) を使用して実行されました。

ヒト腸内細菌の模擬コミュニティは、日本微生物コレクションから入手した15の分離株（補足表S4）を使用して調製されました。 等量のすべてのグリセロールストックの混合物を模擬細菌群として使用した。 模擬細菌群集を水を使用して 100 倍に希釈した後、希釈液 (10 μL) を DNase I (20 μL) で 30 °C で 30 分間処理しました。 細胞を水（１ｍＬ）に懸濁することにより３回洗浄し、１８，０００×ｇで５分間遠心分離することにより回収し、水（１０μＬ）に懸濁した。 上記の MDA-in-AGM の後、SYBR Green I を使用して顕微鏡を使用して AGM を観察しました。 顕微鏡の視野にある多数の AGM の中で、増幅された DNA を含む AGM はほんのわずかであり、以下に説明するようにマイクロマニピュレーターを使用して分離されました。

模擬細菌群集の組成を決定するために、DNeasy Ultra Clean Microbial Kit (Qiagen) を使用して全 DNA を抽出しました。 メタゲノム配列決定は、QIAseq FX DNA Library Kit (Qiagen)を用いてライブラリーを調製することによって実施した。 モックコミュニティにおける 16S rRNA 遺伝子のアンプリコン配列決定も、Nextera XT Index Kit 96 インデックス (Illumina, Inc.、カリフォルニア州サンディエゴ) および Reagent Kit V3 (600 サイクル) を備えた MiSeq プラットフォームを備えたライブラリーを調製することによって実行されました。 模擬コミュニティの細菌組成は、QIIME257 で解析された結果に基づいて推定されました。

木材を食べるシロアリ Reticulitermes speratus の標本は、日本の茨城県つくば市で収集されました。 5 匹の働きシロアリの腸を取り出し、腸内容物を 9.2 mM NaHCO3、5.1 mM クエン酸三ナトリウム二水和物、13 mM KH2PO4、37 mM NaCl、0.75 mM CaCl2 および 0.4 mM MgSO4 からなる溶液 U58 に懸濁しました。 細胞外 DNA と原生生物 DNA を DNase I を使用して消化し、細菌細胞を 18,000 xg で 5 分間の遠心分離によって収集し、上記のように水で洗浄しました 43。 洗浄したシロアリ腸内細菌を水 (10 μL) に懸濁しました。 懸濁液を模擬コミュニティとして使用して、シロアリ腸内細菌の MDA-in-AGM を実行しました。

SYBR Green I で検出した増幅 DNA を含む AGM を、マイクロマニピュレーター (TransferMan NK2; Eppendorf, Hamburg, Germany) を備えた倒立蛍光顕微鏡下で PCR チューブに個別に移しました。 単一の AGM を含む各 PCR チューブに水 (29 μL) を加え、60 °C で 5 分間インキュベートし、アガロースシェルを分離して DNA を放出しました。 汚染の程度を確認するために、前述のように 16S rRNA 遺伝子の直接サンガー配列決定によって MDA-in-AGM 製品をスクリーニングしました。 汚染されたサンプルを除去した後、QIAseq FX DNA ライブラリー キットを使用してシーケンス ライブラリーを調製しました。 AGM コア内の MDA 産物は小さすぎて定量できないため、ライブラリー構築における断片化およびライゲーション時間は、メーカーの説明書に記載されている 10 ng 未満のインプット DNA の条件を使用して実行されました。 ゲノム配列決定は、Reagent Kit V3 (600 サイクル) を使用して MiSeq プラットフォームで実行されました。 FACS を使用してシロアリの腸内細菌叢から単離された単一細胞の配列ライブラリーは、Nextera XT DNA Library Prep Kit (Illumina) を使用して調製され、Illumina HiSeq 2500 プラットフォーム (500 サイクル) で分析されました。

生成されたショートリードは、Cutadapt (https://github.com/marcelm/cutadapt)、PRINSEQ (http://prinseq.sourceforge.net/)、FASTX Trimmer、FASTQ Quality Trimmer (http://hannonlab.cshl) を使用してトリミングされました。 .edu/fastx_toolkit/download.html) および cmpfastq_pe (http://compbio.brc.iop.kcl.ac.uk/software/download/cmpfastq_pe)。 トリミングされたリードは SPAdes ver. を使用してアセンブルされました。 3.13.0 (k-mer: 21、33、55、77、99、および 127、オプション: -sc、-careful)28 をコンティグに追加します。 その後の分析のために、SeqKit (https://bioinf.shenwei.me/seqkit/) を使用して、1 kb を超えるコンティグのみが選択されました。

シロアリ腸サンプルからの単細胞ゲノムの分類学的分類は、ゲノム分類データベース ツール キット (GTDB-Tk)44 を使用して実施されました。 CheckM29 を使用して識別された、5% を超えるコンタミネーションを示すゲノム配列データは、metaWRAP31 の BINNING (metaBAT259、MaxBin260、CONCOCT61 を含む)、BIN_REFINEMENT、および REASSEMBLE_BINS モジュールを使用したビニング、精製、および再アセンブリのプロセスに連続して適用されました。

大腸菌 DH5α およびヒト腸内細菌を用いた単一細胞ゲノム解析の対象範囲の増加 (図 3) では、Trimmomatic62 を使用してアダプターでトリミングされたリードが Rasusa63 を使用してランダムに選択され、SPAdes28 を使用して de novo で組み立てられました。 アセンブリ内のゲノムの完全性とコンティグの数は CheckM29 を使用して評価され、R を使用してプロットされました。さまざまなカバレッジに対応するシーケンシングリードは、Bowtie264 を使用して既知のゲノム配列にマッピングされ、結果は IGV ver. を使用してヒートマップとして視覚化されました。 2.3.26 (http://software.broadinstitute.org/software/igv/)。 カバーされたゲノム (%) は、1 kb-bin あたり少なくとも 1 つのリードでカバーされたゲノム領域であり、BBtools (http://jgi.doe.gov/data-and-tools/bbtools/) を使用して計算されました。

SAG の増幅バイアスは、ジニ係数とローレンツ曲線を使用して評価されました。 Bowtie264 を使用して SAG のシーケンシングリードを参照ゲノム上にマッピングした後、ゲノムを 60 倍 (大腸菌) および 40 倍 (ヒト腸内細菌) カバーするようにリードがランダムに選択され、塩基ごとのシーケンシング深度は以下から計算されました。 SAMtools (http://www.htslib.org) を使用して読み取ります。 SAG のジニ係数は、R ineq パッケージを使用して、50 kb ビンあたりの平均シーケンス深度から計算されました。 SAG は、中央値に等しいジニ係数を持ち、R gglorenz パッケージを使用してローレンツ曲線上にさらにプロットされました。

キメラリード率は、Barrows-Wheeler Aligner (https://sourceforge.net/projects/biobwa/files/) および SAMtools を使用してショートリードを参照ゲノムにマッピングすることによって計算されました。 参照ゲノムは補足表S4にリストされています。 CheckM29 (補足表 S7) を使用した 5% 未満のコンタミネーションのゲノム シーケンシング データのクロスコンタミネーションは、シーケンシング リードをモック コミュニティの参照ゲノムにマッピングすることによって計算されました 16。

生の fastq ファイル (DRR253532 ～ DRR253885) とシロアリ腸内細菌の SAG のアセンブリ (BNTM01000000 ～ BOCE01000000) は、BioProject アクセッション番号 PRJDB10679 として DDBJ に寄託されました。

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この研究は、理化学研究所先駆的プロジェクト「共生の生物学」、JSPS 科研費助成金 16K07224 (H. A 氏)、17H01447 および 19H05679 (MO 氏)、および大阪発酵研究所 (MY 氏) の支援を受けました。

These authors contributed equally: Hiroyoshi Aoki, Yuki Masahiro, Yuichi Hongoh, Moriya Ohkuma and Yutaka Yamagata.

〒351-0198 埼玉県和光市広沢3-1 理化学研究所 先進フォトニクス研究センター 先端フォトニクス技術グループ 超高精度光学技術チーム

Hiroyoshi Aoki & Yutaka Yamagata

〒305-0074 茨城県つくば市高野台3-1-1 理化学研究所バイオリソース研究センター 日本微生物コレクション（JCM）

Yuki Masahiro, Michiru Shimizu, Yuichi Hongoh & Moriya Ohkuma

東京工業大学生命理工学院、東京、日本

Yuichi Hongoh

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YY と MO が研究を監督しました。 HA、MY、YH、MO が研究をデザインしました。 HAさん、MYさん、YHさんが原稿を書きました。 HA は AGM 準備プロトコルを開発しました。 MY と MS は、次のゲノム配列決定とそれに続くデータ分析を実行しました。 すべての著者が原稿に貢献し、編集しました。

青木広義または大隈守也への通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

青木 洋、正博 裕、清水 正 他アガロースゲルマイクロカプセルにより、調製が容易なピコリットルスケールの単一細胞ゲノミクスが可能になり、高カバー率のゲノム配列が得られます。 Sci Rep 12、17014 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-20923-z

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受信日: 2022 年 1 月 19 日

受理日: 2022 年 9 月 21 日

公開日: 2022 年 10 月 18 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-20923-z

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