浸潤足は乳がん細胞の共同的な浸潤と転移を可能にします

Communications Biology volume 5、記事番号: 758 (2022) この記事を引用

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メトリクスの詳細

浸潤癌細胞と非浸潤癌細胞は、共同浸潤中に一緒に浸潤する可能性があります。 しかし、それを引き起こす出来事、上皮間葉転換の役割、およびこれが転移に及ぼす影響は不明です。 この研究では、同質遺伝子型 4T1 および 67NR 乳がん細胞が 3D スフェロイド内で互いに選別され、その後、協力的に浸潤することを実証します。 微速度撮影顕微鏡法により、浸潤性 4T1 細胞は非浸潤性 67NR と比較してより持続的に移動し、スフェロイドとマトリックスの界面で選別および蓄積し、このプロセスは細胞とマトリックスの接着に依存し、E-カドヘリン細胞と細胞とは独立していることが示されました。癒着。 4T1 細胞における浸潤足の除去は浸潤をブロックし、浸潤足の要求がリーダー細胞に限定されることを示しています。 重要なことに、我々は、前臨床マウスモデルにおいて、浸潤足のある細胞とない細胞も協調的な転移に関与できることを実証しました。 まとめると、我々の結果は、浸潤足を持つ少数の細胞が不均一な細胞クラスターの転移を促進する可能性があることを示唆しています。

癌患者の 90% 以上は、転移、つまり二次臓器における癌細胞の播種、再播種、増殖のプロセスに起因する合併症により死亡しています 1,2。 乳がんでは、最近の研究により、転移は主にポリクローナル播種から生じることが実証されました 3,4。 これらのポリクローナル転移は、複数の単一クローンの連続的な蓄積とは対照的に、細胞クラスターの集団的播種から発生します。 原発腫瘍内の表現型の不均一性に関する文献の増加5と合わせて、これらの観察は、がん細胞のクローン間の協力性​​が転移を促進する可能性があることを示唆しています。

乳がんでは、がん細胞が運動性の統合や細胞外マトリックス (ECM) を分解する能力などの浸潤特性を獲得すると、転移カスケードが開始されます2。 浸潤と運動性はどちらも、一般的に上皮間葉転換 (EMT) プログラムの活性化に関連しています6。 EMT中、上皮細胞は細胞間の接触を徐々に失い、ECMへの接着を徐々に強化し、収縮性を高めて運動性を高めます。 EMT と同時に、がん細胞は浸潤足を使用して ECM を局所的に分解する能力も獲得できます 7、8、9、10。 浸潤仮足は、がん細胞に高いタンパク質分解活性を与え 11,12、そして重要なことに転移能の上昇をもたらすマトリックスメタロプロテイナーゼ (MMP) が豊富な膜突起です 13,14。 EMT プログラムはバイナリでも一方向スイッチでもありません。また、複数の EMT ルートが存在するため、異なる EMT 軌跡により、異なる浸潤レベルの癌クローンが生じる可能性があります 15。

乳がんに関する最近の 3D in vitro 研究では、浸潤集合鎖が複数の浸潤特性が異なるがん細胞で構成されていることが示されました 3,16,17,18,19,20。 たとえば、リーダー細胞は、フォロワー細胞と比較して、収縮性 19、細胞と ECM の接着 3,16、ECM リモデリング 20、および ECM 分解能力 18,19 の増加を示します。 その結果、リーダー細胞は、本来は非侵襲性であるフォロワー細胞の侵入を可能にする可能性があり、この現象は協調的侵入と呼ばれます21。 我々の最近の研究では、リーダー細胞の大部分が細胞周期の G1 期に存在することが示されました。G1 期は、浸潤足を介した ECM 分解が最も高くなる細胞周期の期です 22。 これらのデータは、集団浸潤中にリーダー細胞が優先的に浸潤足を組み立てる可能性があることを示唆しています。 ECMの分解が集団的侵入には明らかに必要であるが、リーダー細胞とフォロワー細胞における浸潤足媒介ECM分解の役割は不明である。 現在までのところ、協力的な侵略に先立つ可能性のある空間再編について詳しく述べた研究はありません。 さらに、これまでの研究はすべて 3D 培養における協力的な浸潤を調査していたため、播種および転移中の協力についてはまだ調査されていませんでした。

この研究では、異なる浸潤スキルを持つがんクローンが浸潤と転移の際にどのように協力するかを理解することを目的としています。 我々は、浸潤性クローンが非浸潤性クローンから選別され、それを協力的な浸潤と転移に導くことができることを示す。 私たちの研究は、がん細胞間の協力性​​が集団転移の効率的なメカニズムである可能性があることを示唆しています。

異なる浸潤スキルを持つがんクローンが転移中にどのように連携するかを調査するために、Balb/C マウスと同系の乳がん細胞株 4T1 および 67NR の同質遺伝子ペアを使用しました 23,24。 同所性移植では、両方の細胞株が原発腫瘍を成長させますが、転移するのは 4T1 細胞のみです 25。 我々は、MMP によるマトリックスの分解を必要とする高密度コラーゲン I におけるスフェロイド浸潤アッセイで 4T1 細胞と 67NR 細胞の浸潤能力を評価しました 22。 2日後、4T1細胞はコラーゲンIマトリックスへの強い浸潤を示しましたが、67NR細胞は浸潤しなかったことがわかりました（図1a、b）。 汎MMP阻害剤GM6001による処理は、4T1細胞の浸潤を効果的に遮断した（図1a、b）。 さらに、MMP媒介コラーゲンI切断部位（Col¾）の免疫蛍光標識により、マトリックスへの4T1細胞の浸潤がMMP依存性であることが示されました（図1c）。 細胞分裂を阻害するマイトマイシン C による処理 26 により、4T1 細胞の浸潤が細胞増殖によるものではないことが確認されました (図 1a、b、および S1)。 4T1 細胞は、細胞間接合部に E-カドヘリンが存在し、集合鎖として侵入することが知られています 27,28。 4T1細胞はE-カドヘリンを発現し、67NR細胞はN-カドヘリンを発現したことを確認しました（図S2a、b）27、28、29。 4T1 細胞株と 67NR 細胞株は両方ともビメンチンを発現しました (図 S2a)。 興味深いことに、EMT 軸 (上皮から間葉への表現型の連続体) では、浸潤性 4T1 細胞が上皮/間葉系として分類され、非浸潤性 67NR 細胞が間葉系として分類されます。 さらに、4T1 スフェロイドでは、すべての細胞間接合部、つまりリーダー細胞とフォロワー細胞の間、およびフォロワー細胞とフォロワー細胞の間で E-カドヘリンが豊富であることがわかりました。 これにより、E-カドヘリン媒介細胞間接合の完全性が浸潤中に維持されることが証明されました（図S2c、d）30。 全体として、これらの結果は、4T1 細胞が MMP 依存性の集団浸潤を行うのに対し、67NR 細胞は高密度のコラーゲン I マトリックスに浸潤しないことを実証しました。

a 3D コラーゲン I マトリックスへの埋め込み後 0 日目と 2 日目の 4T1 細胞と 67NR 細胞のスフェロイド。 核をDAPIで染色した。 スフェロイドを0日目から汎MMP阻害剤(GM6001、右上パネル)、細胞周期阻害剤(マイトマイシンC、ミトC、右下パネル)またはDMSO対照(左パネル)で処理した。 スケールバー: 100 μm。 b (a) の 4T1 および 67NR セルの時間の関数としての回転楕円体面積。 t 検定による P = 5.81 × 10−4 および 1.23 × 10−4。 c 4T1 スフェロイドの侵入鎖、包埋後 2 日目、MMP 切断コラーゲン I (Col-3/4、緑色) で免疫標識し、F-アクチン (ファロイジン、マゼンタ) と核 (DAPI、青色) で染色。 スケールバー: 50 μm。 d 4T1および67NR細胞におけるTks5およびコルタクチン発現のウェスタンブロット。 β-アクチンはローディングコントロールとして使用されます。 e プレーティングから 18 時間後の 4T1 (上のパネル) および 67NR (下のパネル) 細胞のゼラチン分解。 挿入図はボックス領域の 4 倍ズームインを示し、矢印は代表的な劣化穴を示します。 スケールバー: 20 μm。 F-アクチンについては図S3aを参照してください。 f (e) の 4T1 および 67NR セルの劣化領域。 P < 4.40 × 10−16、ウィルコクソン順位和検定による。 g 蛍光ゼラチン (灰色) 上で培養した 4T1 細胞。Tks5 (緑色) および F-アクチン (ファロイジン、マゼンタ) で標識されています。 挿入図はボックス領域の 2 倍ズームインを示し、矢印は代表的な機能的浸潤足を示します。 スケールバー: 10 μm。 h 包埋後 2 日目の 4T1 鎖。Tks5 (緑色)、切断されたコラーゲン (シアン)、F-アクチン (マゼンタ)、および核 (青色) で標識されています。 挿入図は、ボックス領域の 1.25 倍ズームインを示しています。 スケールバー: 30 μm。 i 創傷後 24 時間の 4T1 (左) および 67NR (右) 単層。 代表的な細胞の軌跡を示します。 ムービー S1 を参照してください。 スケールバー: 100 μm。 j (i) の創傷アッセイからの 4T1 (上) および 67NR (下) 細胞の軌跡。共通の原点にシフトした風配図プロットとして示されています。 k (j) の 4T1 および 67NR セルの瞬間速度。 P = 1.17 × 10−13、ウィルコクソン順位和検定による。 l (j) の 4T1 および 67NR セルの持続性 (正味変位/経路長)。 P < 2.20 × 10−16、ウィルコクソン順位和検定による。 トリミングされていないウエスタンブロットは補足図S13で利用できます。

浸潤足は、アクチン、コルタクチンや Tks5 などのアクチン結合タンパク質、および MMP が豊富に含まれる膜突起です 11、12。 浸潤足の機能は局所的な ECM 分解を引き起こすため、我々は浸潤足が 4T1 細胞の浸潤に役割を果たしているという仮説を立てました。 我々はまた、観察された4T1細胞と67NR細胞の浸潤能力の違いは、少なくとも部分的にはそれらの浸潤足機能の違いによって説明できるのではないかと推論した。 これをテストするために、我々はまず主要な浸潤足構成要素であるコルタクチンと Tks511 の発現レベルを分析しました。 両方の細胞株は、同様のレベルのコルタクチンとTks5を発現しました（図1d）。 次に、蛍光標識ゼラチンの上で細胞を培養することによって浸潤足機能を測定しました。これにより、マトリックスの穴として分解を視覚化できます 31。 4T1細胞はゼラチン層を分解できましたが、67NR細胞は分解できなかったことがわかりました（図1e、f）。 機能的かつ成熟した浸潤足を示す、共局在するTks5、F-アクチン、および分解したゼラチンの点が4T1細胞に存在しました（図1g）。 これは、観察された分解穴が浸潤足によって生成されたことを示唆しています。 浸潤足前駆体を示す、共局在する Tks5 と F-アクチンの涙点は、4T1 細胞と 67NR 細胞の両方に同様のレベルで存在しました（図 S3a、b）。 まとめると、これらの結果は、浸潤足前駆体が 67NR 細胞では成熟しないことを示唆しています。 浸潤足がスフェロイド内の 4T1 細胞の浸潤にも役割を果たしているかどうかを調べるために、F-アクチン、Tks5、および MMP 媒介コラーゲン I 切断部位についてスフェロイドを標識しました。 我々は、F-アクチン、Tks5、およびMMP媒介コラーゲンI切断部位の共局在によって実証された、リーダー細胞における機能的浸潤足を同定した（図1h）。 これらの観察は、浸潤足と4T1細胞の集団的浸潤との間の関連性を確立し、リーダー細胞が浸潤足を組み立てることを示唆している。

浸潤表現型は浸潤足を介した ECM 分解と細胞遊走からなる 32 ため、67NR 細胞が 4T1 細胞と同じくらい効率的に遊走できるかどうかを調べるためにスクラッチ アッセイを実行しました。 個々のセル（図1i、j、およびムービーS1）を追跡したところ、67NRセルの瞬間速度は4T1セルの速度よりも高い（図1k）一方で、4T1セルは67NRセルよりも大幅に持続性が高いことがわかりました（図1l） ）。

要約すると、我々は、4T1/67NR ペアが、異なる浸潤能力を持つがんクローンが浸潤中にどのように連携するかを調査するのに適したツールであることを示しました。

次に、4T1 と 67NR が混在するスフェロイドにおける空間構成と浸潤のダイナミクスの調査に着手しました。 スフェロイド浸潤アッセイの過程での4T1のより高い増殖速度を考慮して、4T1-mScarletおよび67NR-GFP細胞株を生成し、それらを1:50の比率で混合しました（図S4a、b）。 次に、混合スフェロイドをコラーゲン I に埋め込み、毎日縦方向イメージングを実行しました (図 2a および S4c)。 我々は、67NR細胞と4T1細胞が3日目から互いにソートされ始めていることに気づきました。個々の光学スライス（ムービーS2）と細胞座標​​の分析により、スフェロイドの端に4T1細胞が濃縮されていることを明確に示しました（図2bおよびS4d）。 細胞のソーティングを定量化するために、回転楕円体の中心までの各細胞の相対距離を計算しました。この指標を距離インデックス (DI) と名付けました。値 0 は回転楕円体の中心にある細胞をマークし、値 1 は細胞に対応します。スフェロイドとコラーゲンIの界面（図2c）。 包埋後 3 日目に、4T1 細胞の DI が時間の経過とともに増加し、67NR 細胞の DI よりも大幅に高かったことがわかりました (図 2d)。 この傾向は個々の回転楕円体にも存在しました（図S4e）。 これらのデータは、3 日間にわたって、細胞がランダムな分布から、界面に存在する 4T1 細胞とスフェロイドのコアに位置する 67NR 細胞を含むスフェロイドに再編成されたことを明らかにしました。 4〜6日目に、4T1および67NR細胞の細胞選別に続いて浸潤を行いました（図S4f）。

a 4T1-mScarlet (マゼンタ) と 67NR-GFP (緑色) 細胞の比率が 1:50 の混合スフェロイド。3D コラーゲン I に埋め込まれ、毎日画像化されます。 Day 1 は埋め込み後 1 日目を示します。 ムービーS2を参照してください。 スケールバー: 100 μm。 b（a）および図S3cに示されているすべてのスフェロイドからの4T1-mScarlet（4T1-mScar、マゼンタ）および67NR-GFP（緑色）細胞の座標。 c 距離指数 (DI) の概略図。 a と b は回転楕円体の長半径/短半径を表し、d は回転楕円体の中心と細胞の間の距離を表します。 DI は d/a、つまり回転楕円体の中心までの各セルの相対距離です。「材料と方法」を参照してください。 d (a、b)のスフェロイドからの4T1-mScarlet (マゼンタ) および67NR-GFP (緑色のボックス) 細胞のDI。 ウィルコクソン順位和検定による P = 1.32 × 10−14 および <2.20 × 10−16。 e 包埋後 3 日目と 4 日目の混合スフェロイド。 スフェロイドは、細胞収縮性の阻害剤 (ROCK 阻害剤、Y-27632、上のパネル) または汎 MMP 阻害剤 (GM6001、下のパネル) で 0 日目から処理されました。 スケールバー: 100 μm。 f (e) のスフェロイドからの 4T1-mScarlet (マゼンタ) および 67NR-GFP (緑色) 細胞の DI。 g 回転楕円体のエッジ (濃い灰色) とコア (薄い灰色) のコンパートメントの概略図。 h 開始時（0.5 日目、埋め込み後 10 時間）とタイムラプス記録の終了時（2.5 日目、埋め込み後 54 時間）に撮影された混合回転楕円体のスナップショット。 4T1-mScarlet 細胞および 67NR-GFP 細胞の場合、エッジおよびコア コンパートメントの代表的な細胞軌跡が時間に従って色分けされて表示されます (右パネル)。 スケールバー: 100 μm。 i (h) のスフェロイドからの 4T1-mScarlet (マゼンタ) および 67NR-GFP (緑色) 細胞のΔ距離指数 (ΔDI)。 ムービー S3 ～ 6 もご覧ください。 正のΔDIはスフェロイドの端(「アウト」)に向かう細胞の運動性を示し、負のΔDIはスフェロイドの中心(「イン」)に向かう動きを示します。 スフェロイドは0日目からDMSO対照(左)またはGM6001(右)で処理されました。 P = 0.0204、ウィルコクソン順位和検定による。 j (h) のスフェロイドからの 4T1-mScarlet (マゼンタ) および 67NR-GFP (緑色) 細胞の平均二乗変位 (MSD)。 MSD は、それぞれ DMSO (上) と GM6001 (下) で処理したスフェロイドのエッジ (実線) 細胞とコア (破線) 細胞について、極座標系の半径方向 (左) と角度 (右) 方向で計算されました。 プロットは対数対数スケールで表示され、運動性の超拡散性 (α > 1)、拡散性 (α = 1)、および準拡散性 (α < 1) の性質を強調しています。 実線は目のガイドとして機能し、これらのさまざまな運動様式に対応する平均傾き (α 値) を示します。 k べき乗則指数 αr は、回転楕円体のエッジおよびコア コンパートメントからの 4T1-mScarlet (マゼンタ) および 67NR-GFP (緑色) 細胞について示されています (左)。 DMSO コントロール (右上) または GM6001 (右下) について、回転楕円体のエッジおよびコア コンパートメントからの半径方向の実効拡散係数が示されています。

4T1 細胞のスフェロイドは、細胞外空間にラミニン、コラーゲン I、およびフィブロネクチンを含むことが示されています 34。 スフェロイド内に ECM が存在することは、3D 細胞の運動性、そして結果として細胞の選別には MMP が必要である可能性があることを示唆しています。 運動性、MMP、および細胞選別の間の関連性をテストするために、細胞収縮性の阻害剤 (ROCK 阻害剤、Y-27632) または汎 MMP 阻害剤 GM6001 でスフェロイドを処理しました。 両方の処理が細胞選別をブロックすることがわかりました（図2e、f）。 次に、混合スフェロイドのタイムラプス イメージングを実行しました。 回転楕円体内の個々の細胞を追跡し（図2hおよび動画S3、4）、各細胞について、初期距離指数と最終距離指数の差を計算しました（ΔDI = 特定の細胞の最後の位置のDI – 初期位置のDI）所定の細胞の）、正のΔDIは回転楕円体の端に向かう細胞の運動性（図2g、iの「out」）を示し、負のΔDIは回転楕円体の中心に向かう動き（図2g、iの「in」）を示します。 ）。 ΔDI がゼロの場合は、正味の動きがないことを示します。 我々は再び各細胞をエッジまたはコアとしての初期位置に基づいて分類し、エッジコンパートメントをスフェロイドとコラーゲンの界面に最も近い2つの細胞層として定義しました（幅30μmの楕円形リング;図2g）。 タイムラプスイメージングの継続中にコンパートメント間で切り替わった追跡細胞の割合は、最初にコアに位置していた4T1細胞を除くすべての細胞で無視できることがわかりました（図S5a）。 4T1 細胞では、初期位置がスフェロイドの端にあった細胞と比較して、初期位置がスフェロイドのコアにあった細胞の ΔDI が有意に高いことがわかりました (図 2h、i)。 これは、4T1 細胞がスフェロイドのコアからスフェロイドの端に向かって移動したことを示しています。 対照的に、スフェロイドの端に位置する4T1細胞はゼロに近いΔDIを有しており、最初にスフェロイドの端で見つかった4T1細胞がそのコンパートメント内でのみ移動したことを示唆しています（図2i）。 ΔDIは、初期位置に関係なく、すべての67NR細胞で最小であり、これらの細胞が最初に位置していたコンパートメント内でのみ移動したことを示しています（図2i）。 ΔDI はセルの最初と最後の位置を比較するため、このメトリクスはセルの持続性に関する情報を提供しません。 実際、所定の ΔDI に対して、細胞の軌道は多かれ少なかれ曲がりくねっている可能性があります。 回転楕円体の対称性を捉える極座標系でセルの平均二乗変位 (MSD) を計算することにより、4T1 セルが 67NR セル (拡散性、α = 1) (図 2j、k、および S5b–d)。 4T1細胞と67NR細胞は両方とも、角度方向に同様の運動挙動を示しました（図2jおよびS5b、c）。 GM6001によるスフェロイドの処理により、4T1細胞のコアから端への移動が損なわれ（図2i〜k、映画S5、6）、半径方向のすべての細胞の実効拡散係数が減少しました（図2j、 k および S5b–d)。 我々は、スフェロイドの成長がGM6001条件とDMSO条件で同様であることを確認し、細胞選別の喪失が細胞増殖とは独立していることを示唆しました（図S5e）。 総合すると、これらの結果は、混合スフェロイド内での細胞の選別は主に、コアから端のコンパートメントへの 4T1 細胞の指向性運動性と端に留まる能力によって駆動されるのに対し、67NR 細胞はランダム（拡散）運動性を示し、領域内にとどまることを示しています。時間の経過とともに同じコンパートメント。 要約すると、持続性の違いが 4T1 細胞と 67NR 細胞の間の細胞選別を促進することを示しました。

細胞の自己組織化とパターン形成は胚組織や発生過程で盛んに研究されていますが、これまでのところ、癌スフェロイドモデルで 2 つ以上の細胞型の混合物をテストした研究はわずかです 19,20。 ほとんどの研究では、細胞間接着力の違いに基づいて分類を予測する接着差仮説に基づいて細胞が分類され、最も強い細胞間接着を示す細胞が中心に位置すると報告されています 35。 4T1/67NR ペアのカドヘリンの発現に基づいて、接着差仮説は、3D スフェロイドでは、E-カドヘリンを発現する 4T1 が N-カドヘリンを発現する 67NR 細胞から選別され、4T1 細胞が中心に位置し、67NR が配置されると予測します。それを取り囲む細胞。 対照的に、私たちのデータは逆のパターンを示しており（図2a、b）、接着差の仮説が私たちのモデルには当てはまらない可能性があることを示唆しています。 これを確認するために、E-カドヘリンブロッキング抗体を介して4T1細胞の細胞間結合を阻害しました（図3a）。 興味深いことに、E-カドヘリンをブロックしても、4T1細胞と67NR細胞の間の細胞選別は排除されませんでしたが、それが1日遅れました（図3b）。 この結果を確認するために、安定したE-カドヘリンノックダウン細胞株（Ecad-KD1およびEcad-KD2;図3c〜e）を生成しました。 ウェスタンブロット分析によると、E-カドヘリン発現の減少は、Ecad-KD1では36.3%、Ecad-KD2では96.8%でした。 両方のEcad-KD細胞株は67NR-GFP細胞から選別され、包埋後3日目までにスフェロイドの端に蓄積しました（図3g、h）。 全体として、これは、私たちのモデルでは細胞選別が E-カドヘリンから独立していることを示唆しています。

a 包埋後 4 日目に画像化された、1:50 の比率の混合スフェロイド。 スフェロイドを、E-カドヘリン遮断抗体を用いて(+Ab、右パネル)、または用いずに(-Ab、左パネル)処理した。 スケールバー: 100 μm。 b (a) のスフェロイドからの 4T1-mScar (マゼンタのボックス) および 67NR-GFP (緑色のボックス) 細胞の DI。 ウィルコクソン順位和検定によると、それぞれ P = 2.78 × 10−5、<2.2 × 10−16、1.12 × 10−12。 c 2D の Ecad-CTL、Ecad-KD1、および -KD2 セル。 E-カドヘリン (緑色、下のパネル) と核 (灰色、上のパネル) が示されています。 d (c)の細胞からのE-カドヘリンシグナルの統合密度。 ウィルコクソン順位和検定による P = 4.85 × 10−12 および <2.2 × 10−16。 e Ecad-CTL、-KD1、および-KD2細胞におけるE-カドヘリン発現のウェスタンブロット。 β-アクチンはローディングコントロールとして使用されます。 f Ecad-CTL、-KD1、または -KD2 スフェロイドのスフェロイドあたりの鎖の数 (黒) とスフェロイドあたりの単一細胞の数 (青)。 赤い空の記号はゼロ値を示します。 t 検定による P = 9.01 × 10−10、1.06 × 10−3 および 1.74 × 10−5。 g 包埋後 4 日目に画像化された、1:50 の比率の混合スフェロイド。 Ecad-CTL、-KD1、または-KD2細胞を使用しました。 スケールバー: 100 μm。 h (g) のスフェロイドからの Ecad-CTL、-KD1 および -KD2 (マゼンタのボックス) および 67NR-GFP (緑色のボックス) 細胞の DI。 ウィルコクソン順位和検定による P = 4.72 × 10−5、<2.20 × 10−16、2.21 × 10−5、2.12 × 10−15、2.05 × 10−13 および <2.20 × 10−16。 トリミングされていないウェスタンブロットは補足図で利用できます。 S14～S15。

細胞の選別は包埋後3日目までに起こり（図2a、d）、スフェロイドの端での4T1細胞の蓄積は3D浸潤全体にわたって維持されたため（図2i）、4T1細胞とECMの相互作用は細胞選別を維持するために重要である可能性があります。 これをテストするために、混合スフェロイドをアガロースで構成される非接着性マトリックスに配置しました。 3日目と4日目では、DIは4T1細胞と67NR細胞の両方で同様であり、アガロースに埋め込まれた細胞が選別されなかったことを示しています（図4a、b）。 スフェロイドコアの面積は、コラーゲンIマトリックスとアガロースマトリックスの両方で同様であり、細胞選別の損失が細胞増殖とは独立していることを示しています（図S6a）。 この細胞選別の欠如は、接着性 ECM なしでは 4T1 細胞がスフェロイドの端に留まらないためである可能性があります。 これをリアルタイムでテストするために、アガロースに埋め込まれた混合スフェロイドのタイムラプスイメージングを実行し、個々の4T1細胞を追跡しました（図4c;ムービーS7）。 最初にエッジコンパートメントに位置した細胞の平均ΔDIは負であり、最初にコアコンパートメントに位置した細胞ではゼロに近いことがわかりました（図4d）。 これは、4T1 細胞がスフェロイドのエッジ コンパートメントからコア コンパートメント (動画 S8)、およびコア内 (動画 S7) に移動することを示しています。 エッジコンパートメントに入ったこれらの 4T1 細胞は、その後そこから出ますが、これはコラーゲン I マトリックスに埋め込まれたスフェロイドでは観察されませんでした (ムービー S9)。 興味深いことに、半径方向のセルのMSDを計算することにより、4T1（超拡散、α > 1）セルと67NR（拡散、α = 1）セルの間の持続性の差が維持されていることがわかりました（図4eおよびS6b- d)、接着性 ECM インターフェースが細胞選別に必要であることを示唆しています。

a 包埋後 3 日目または 4 日目に画像化されたアガロースマトリックス内の混合スフェロイド。 スケールバー: 100 μm。 b (a) のスフェロイドからの 4T1-mScarlet (マゼンタのボックス) および 67NR-GFP (緑色のボックス) 細胞の DI。 c 3DコラーゲンIマトリックスで培養された混合スフェロイドの44時間のタイムラプス記録のスナップショット。 画像は、包埋後 10 時間 (0.5 日目) および 54 時間 (2.5 日目) に撮影されました。 明確にするために、4T1-mScarlet 細胞のみを示しています。 代表的な細胞の軌跡を時間に従って色分けして示します (右パネル)。 ムービー S7 ～ 9 もご覧ください。 スケールバー: 100 μm。 d (c)のスフェロイドからの4T1-mScarlet細胞のΔDI。 P = 7.50 × 10−4、ウィルコクソン順位和検定による。 e べき乗則指数 αr は、エッジおよびコア コンパートメントからの 4T1-mScarlet (マゼンタのバー) および 67NR-GFP (緑色のバー) セルについて示されています。 f 2D細胞-ECM競合アッセイの概略図（左）と、プレーティング後24時間のゼラチン/ポリ-L-リジン（PLL）界面に存在する細胞への拡大図（上、右パネル）。 4T1-mScarlet (下、左パネル) および 67NR-GFP (下、右パネル) 細胞をゼラチンアイランド上にのみプレーティングしました。 ムービー S10 も参照してください。 スケールバー: 200 μm。 g (f) のポリ-L-リジン (PLL) 上の 4T1-mScarlet (マゼンタのボックス) および 67NR-GFP (緑色のボックス) 細胞の割合。 h プレーティングから 5 時間後の、ポリ-L-リジン (PLL) またはゼラチン上の 4T1-mScarlet および 67NR-GFP 細胞の接触角 (θ) (上) および直交 xz ビューの概略図。 スケールバー: 5 μm。 i (h) の細胞の接触角 θ。 PLL、4T1 対 67NR: P = 1.25 × 10−9; 4T1、PLL 対ゼラチン: P = 4.13 × 10−10、Wilcoxon 順位和検定による。

このことから、67NR 細胞と比較して、4T1 細胞は優先的に ECM に接着するという仮説が立てられました。 4T1 および 67NR 細胞の ECM に対する接着特性を比較するために、両方の細胞タイプを円形ゼラチン アイランド (直径 5.5 mm) の上部にポリ-L-リジンでプレーティングする 2D 細胞-ECM 接着競合アッセイを開発しました。島の間にコーティングが存在します（図4f）。 24時間後、ゼラチンアイランドからポリ-L-リジンでコーティングされた領域に移動した4T1および67NR細胞の数を記録しました。 24時間の時点でポリ-L-リジン領域に存在する細胞の85％が67NR細胞であることがわかりました（図4g）。 これを説明するために、タイムラプス動画を分析したところ、4T1 細胞がゼラチンからポリ-L-リジン領域に移動するというまれなイベントでは、細胞が最終的にゼラチンに戻って移動することがわかりました (動画 S10)。 これは、4T1 細胞が 67NR 細胞よりもゼラチンに対する接着強度が高いことで説明できるのではないかと考えました。 これをテストするために、ゼラチンまたはポリ-L-リジン上にプレーティングされた細胞の接触角を測定しました（図4h）。 細胞とマトリックスの接触角は、接着強度とともに増加することが以前に示されています 36。 ゼラチン上にプレーティングした場合、両方の細胞タイプが同様の接触角を示すことがわかりました（図4i）。 ただし、ポリ-L-リジン上にプレーティングされた4T1細胞は著しく低い接触角を示しましたが、67NR細胞はゼラチンとポリ-L-リジンの両方で同様の接触角値を示しました（図4i、67NR細胞と比較して4T1細胞は、 ECM の存在に対してより感受性です.ECM に対するこの親和性は、67NR 細胞よりも 4T1 細胞で観察される FAK と p-FAK の両方のレベルが高いことと一致しています (図 S6e)。 67NR 細胞をゼラチン上にプレーティングすると、同型接触のパーセンテージがプレーティング時 (0 時間) とプレーティング後 24 時間で同様であることがわかりました (図 S6f、g)。これにより、4T1 細胞と 67NR 細胞がソートされないことが確認されました。 2Dでは、細胞間の接着差が私たちのシステムにおける細胞選別の主な要因ではないことを再度確認し、細胞選別を開始するための細胞-ECMインターフェースの要件を強調しています35。

3日目と4日目にスフェロイド内の4T1細胞と67NR細胞を選別した後、5日目と6日目に浸潤が起こりました（図2a、5a、およびS4c）。 がん細胞が集団的に浸潤するメカニズムの 1 つは協調的浸潤です。浸潤リーダー細胞は ECM 内にマイクロトラックを作成し、そこを通って非浸潤細胞が後続することができます 18、19、20、21。 4T1 細胞と 67NR 細胞は異なる浸潤スキルを示すため、我々は 4T1 細胞が非浸潤性 67NR 細胞の協力的な浸潤を可能にする可能性があると推論しました。 この仮説を検証するために、包埋後 6 日目に混合スフェロイドを分析しました。 混合スフェロイド中に存在する非浸潤性の67NR細胞がコラーゲンIマトリックスに進入したことを観察しました（図5a）。 したがって、67NRのみのスフェロイドと比較して、混合スフェロイドはスフェロイドあたりのストランド数が多く（図5b）、ストランドの約3分の1に67NR細胞が含まれていることがわかりました（図5c）。 重要なことに、混合スフェロイドでは、鎖の大部分が4T1細胞によって導かれ（図5d）、これが浸潤足を組み立てます（図1h）。 4T1細胞の浸潤に対するMMP依存性（図1a）と一致して、GM6001は混合スフェロイド浸潤をブロックしました（図4a〜c）。 協調的浸潤中、4T1細胞と67NR細胞の間の細胞選別は浸潤鎖内およびスフェロイド内で維持され（図5e〜g）、4T1細胞はスフェロイドとマトリックスの境界面に並んでいます。 全体として、これらの発見は、コラーゲン I への混合スフェロイドの協調的侵入が MMP 依存性であり、4T1 細胞がリーダーの位置を占めることを示しています。

a 単一または混合 (1:50) の 4T1-mScarlet 細胞と 67NR-GFP 細胞で作られたスフェロイド。包埋後 6 日目に画像化されます。 スフェロイドをDMSO対照(左パネル)またはGM6001(右パネル)で処理した。 スケールバー: 100 μm。 スフェロイドあたりのストランドの数 (b)、67NR 細胞を含むストランドの数 (67NR + ) (c)、および 4T1-mScarlet (マゼンタのボックス) または 67NR-GFP (緑色のボックス) 細胞によって導かれるストランドのパーセント (d) (a) の単一または混合 (白いボックス) スフェロイドの場合。 赤い空の記号はゼロ値を示します。 P = 1.90 × 10−7 (b) および 9.86 × 10−6 (c)、Wilcoxon 順位和検定による。 e (a) の混合回転楕円体の中央スライス。 スケールバー: 100 μm。 f (e) の混合スフェロイドからの 4T1-mScarlet (マゼンタ) および 67NR-GFP (緑の十字) 細胞の座標。 鎖内に存在する細胞は分析から除外されるか (左のパネル)、または分析に含められます (中央のパネル)。 g（e、f）のスフェロイドからの4T1-mScarlet（マゼンタ）および67NR-GFP（緑色）細胞のDI。 ウィルコクソン順位和検定による P < 2.20 × 10−16 および <2.20 × 10−16。 h 67NRと1:50の比率で混合したEcad-CTL、-KD1、または-KD2細胞のスフェロイド。包埋後6日目に画像化。 スケールバー: 100 μm。 (h) からのスフェロイドの鎖の数 (i) および 67NR-GFP 細胞を含む鎖の数 (67NR + ) (j)。 (i) では P = 0.02 および 6.1 × 10−5。 ウィルコクソン順位和検定による (j) の 0.00073 および 8.70 × 10−8。 k (h) のスフェロイドの場合、スフェロイド コアの外側で見つかった単一細胞の数。 P = 0.02 および 6.1 × 10−5。

これまでの我々の結果は、67NR細胞がコラーゲンIマトリックスに入るには4T1を介したECM分解が必要であることを示唆している。 我々は、コラーゲン I マトリックスに 4T1 細胞が存在することが、コラーゲンを分解してマイクロトラックを作成するのに必要かつ十分であると仮説を立てました。 これを確認するために、4T1 細胞をスフェロイド内の 67NR 細胞と事前に混合する代わりに、4T1 細胞が存在するコラーゲン I マトリックスに 67NR スフェロイドを埋め込みました。 混合スフェロイドでの観察と同様に、コラーゲンIマトリックスに4T1細胞が存在すると、67NR細胞がマトリックスに侵入し、この侵入がMMP依存性であることがわかりました（図S7a、b）。 4T1細胞によって放出された可溶性MMPがコラーゲンIマトリックスへの67NR細胞の浸潤を促進した可能性を排除するために、我々は67NR細胞のスフェロイドを4T1細胞からのならし培地で培養した。 4T1細胞から67NR細胞に馴化培地を提供することは、67NR細胞がコラーゲンIマトリックスに侵入するのに十分ではないことを発見しました（図S7c、d）。 混合スフェロイドでは、先頭の4T1細胞とそれに続く67NR細胞で満たされたコラーゲンIマトリックスの内部のマイクロトラックを特定しました（図S7e）。 癌関連線維芽細胞と上皮癌細胞の間のヘテロタイプの協力的浸潤に関する以前の報告では、ヘテロタイプの N-カドヘリン/E-カドヘリン接着の関与が実証されています 37。 4T1細胞と67NR細胞の間に異型のE-カドヘリン/N-カドヘリン結合は検出されませんでした（図S8a〜c）。これは、これらの細胞間の協調的浸潤がE- / N-カドヘリン相互作用に依存していないことを示唆しています。 全体として、我々のデータは、4T1 細胞がコラーゲン I マトリックスを分解し、67NR 細胞が 4T1 細胞によって作られたマイクロトラックに移動することを示唆しています。

我々は、細胞選別には影響を及ぼさなかったE-カドヘリンの阻害（図3f、g）が協調的侵入に影響を与える可能性があるのではないかと疑問に思いました。 これをテストするために、浸潤が起こる6日目に4T1、Ecad-CTL、-KD1、および-KD2スフェロイドを画像化しました（図5h）。 Ecad-KD1細胞株は集団浸潤から単一細胞浸潤への部分的移行を示し、浸潤鎖および単一浸潤細胞を伴いましたが、Ecad-KD2では単一細胞浸潤への完全な移行が観察されました。 同様に、Ecad-CTLまたは-KDのいずれかを含む67NR細胞を含む混合スフェロイドでは、Ecad-CTLおよびEcad-KD1細胞が浸潤鎖を形成する一方で、両方のEcad-KD細胞株は単一細胞浸潤を示しました（図5i-k）。 集団的および単一細胞の侵入モードの両方における協力的侵入の発生を定量化するために、鎖（図5j）または単一細胞（図5k）のいずれかに存在する67NRフォロワーの数を測定しました。 我々の結果は、67NRが浸潤鎖を維持するEcad-KD1細胞を追跡できる一方で（図5i）、Ecad-KD2と67NRの混合スフェロイドなど、単一細胞浸潤への完全な移行の存在下では、協力的な浸潤が失われることを示しています。 (図5k)。

4T1媒介ECM分解が協調的浸潤に必要であること（図4およびS6）、および4T1リーダー細胞が浸潤足を組み立てること（図1h）を考えると、特に4T1細胞による浸潤足の組み立てがECM分解の原因であるかどうか疑問に思いました。 浸潤足機能ががん細胞の協調的浸潤に必要であることを厳密に確認するために、マウス Tks5 (Tks5-KD)13 のノックダウンを使用して 4T1-mScarlet 細胞の浸潤足を安定的に除去し、対応するコントロール (Tks5-CTL) 細胞株を確立しました。 (図6a、上、ノックダウン効率78.1%)。 また、Tks5-CTLおよびTks5-KD細胞株が依然としてE-カドヘリンを発現していることも検証しました（図6a、下）。これは、スフェロイド内のTks5-CTL細胞とTks5-KD細胞の間の接合部に局在していました（図S9a、b）。 。 2Dのゼラチン分解アッセイおよび3Dのスフェロイド浸潤アッセイによって、Tks5-KD細胞が浸潤能力を失ったことを確認しました（図6b〜e）。 次に、Tks5-CTL 細胞と Tks5-KD 細胞を含む混合スフェロイドのスフェロイド浸潤アッセイを実行しました。 包埋後2日目に、Tks5-CTL細胞と非浸潤性Tks5-KD細胞の両方がコラーゲンIマトリックスに入っていることを発見しました（図6d）。 混合スフェロイドはTks5-CTLと同様の数の鎖を持ち（図6e）、ほとんどの鎖は両方の細胞型を含み（図6f）、Tks5-CTL細胞によって導かれました（図6g）。 協調的浸潤が細胞型特異的であるかどうかをテストするために、E-カドヘリンを発現せず、機能的な浸潤足を組み立てる転移性ヒト細胞株 MDA-MB-231 を選択しました 13。 MDA-MB-231細胞でヒトTks5をノックダウンすることにより（図S10a〜c）、浸潤足を持たない細胞が協力的な浸潤を介して浸潤足を有する細胞を追跡できることが観察され（図S10d〜g）、結果を強化しました。 癌細胞の共同浸潤における浸潤足の重要性をさらにテストするために、混合 Tks5-KD および 67NR-GFP スフェロイドを生成しました。 ここでは、侵入鎖は観察されませんでした（図6h、i）。 最後に、異なる Tks5 shRNA 配列である Tks5-KD2 を使用して結論を​​検証し、Tks5-KD と同様の結果が得られました (図 S11)。 全体として、我々は、協調的浸潤中のリーダー細胞では機能的な浸潤足が必要である一方、フォロワー細胞は浸潤足を欠く可能性があることを実証する。

a Tks5-CTL 細胞および Tks5-KD 細胞における Tks5 (上)、および E/N-カドヘリン (下) の発現。 b プレーティングから 18 時間後の Tks5-CTL (上のパネル) および Tks5-KD (下のパネル) によるゼラチンの分解。 挿入図はボックス領域の 2 倍ズームインを示し、矢印は代表的な劣化を示しています。 スケールバー: 20 μm。 c (b) の Tks5-CTL および Tks5-KD 細胞の細胞あたりの分解面積。 P < 2.2 × 10−16、ウィルコクソン順位和検定による。 d Tks5-CTL、-KD、またはTks5-CTLと-KDの混合物（1：1比）細胞で作られたスフェロイドの2日目の画像。 スケールバー: 100 μm。 スフェロイドあたりのストランドの数 (e)、Tks5-KD 細胞を含むストランドの数 (f)、(d) のスフェロイド内の Tks5-CTL および -KD 細胞によって導かれるストランドの割合 (g)。 P = 1.54 × 10−7 および 2.89 × 10−5、(e) のウィルコクソン順位和検定による。 P = 6.69 × 10−11、(f) の t 検定による。 h 67NR-GFP と 4T1-mScarlet (4T1-mScar) または Tks5-KD 細胞で作られた混合スフェロイド (1:50 比) の 6 日目の画像。 スケールバー: 100 μm。 i (h) からの回転楕円体あたりのストランドの数。 P = 3.36 × 10−6、ウィルコクソン順位和検定による。 j DAPI (青) で標識された、4T1-mScarlet と 67NR-GFP の混合腫瘍。 スケールバー: 50 μm。 k 4T1、67NR、Tks5-CTL、またはTks5-KD細胞を接種したマウスのcm2あたりの肺コロニーの数。 赤い空の記号はゼロ値を示します。 P = 0.032、ウィルコクソン順位和検定による。 l 単一の 67NR 細胞を接種されたマウス、または 4T1 細胞と混合されたマウスの cm2 あたりの肺コロニーの数。 および単一の Tks5-KD 細胞、または Tks5-CTL 細胞と混合します。 赤い空の記号はゼロ値を示します。 P = 0.032、ウィルコクソン順位和検定による。 トリミングされていないウェスタンブロットは補足図で利用できます。 S16 ～ S18。

また、浸潤足の除去が細胞選別に影響を与えるかどうかもテストしました。 予想通り、細胞選別はTks5-CTL細胞とTks5-KD細胞の混合スフェロイドでは起こりませんでしたが（図S12a）、Tks5-KD細胞と67NR-GFP細胞を含むスフェロイドでは起こりました（図S12b）。 これらの発見により、細胞選別には浸潤足が必要ないことが確認されました。 Tks5-CTLおよびTks5-KD細胞は同様の運動性と細胞-ECM接着特性を示すため（図S12c、d）、これらの観察は、細胞選別が行われるための異なる運動性と異なる細胞-ECM感度の要件も強化します。 これに従って、4T1-mScarletおよび4T1野生型細胞を含むスフェロイドでは細胞選別は起こらなかった（図S12e、f）。

播種と転移には、癌細胞の経内皮遊走、つまり血管内侵入と血管外遊出が必要ですが、これは浸潤足に依存することが以前に示されています 13,38。 原発腫瘍および周囲組織の間質性 ECM はマイクロトラック形成によって永続的に再構築される可能性があります 39 が、経内皮遊走には血管周囲 ECM の短時間かつ一時的な開口が伴います 40。 浸潤性細胞と非浸潤性細胞が転移中に協力する可能性があるかどうかは不明です。 浸潤足のある細胞が浸潤足のない細胞の転移を可能にするかどうかを調べるために、我々は単一または混合細胞株で腫瘍を生成しました。 腫瘍が直径 6 ～ 9 mm に達した後、消化された組織に対して肺クローン原性アッセイを実行しました。 どの細胞タイプが転移性肺コロニーを成長させているかを判断するために、蛍光タンパク質の発現または薬剤感受性の違いを利用しました。 Tks5ノックダウンがTks5-KD腫瘍で維持されていることを確認しました（図S11i）。 我々は、対照細胞および野生型細胞とは対照的に、4T1またはMDA-MB-231バックグラウンドのTks5-KD細胞株および67NR細胞が肺転移能がないことを発見した（図6kおよびS10i、S11j）。 4T1細胞と67NR細胞を同時注射した場合、67NRは転移しなかった(図6l)。 67NR細胞が腫瘍組織に存在していたため、これは4T1細胞が引き継いだためではありませんでした（図6j）。 同様に、MDA-MB-231コントロールとその対応するTks5ノックダウンD2-KDの同時注射は、コントロール細胞のみが転移できることを実証しました（図S10h、i）。 興味深いことに、Tks5-KDをTks5-CTL細胞と同時注射すると、両方の細胞型が肺で観察され（図6l）、これは協調的な転移が起こったことを示唆している。 まとめると、これらの結果は、共同転移が浸潤足、E-カドヘリン発現および/または細胞間接合の存在に依存していることを示唆しています。

この研究では、浸潤細胞が協調的な浸潤と転移の際に非浸潤細胞から選別し、非浸潤細胞を導くことができることを示します。 スフェロイド内の細胞の動きを調べることにより、異なる持続性と ECM 感度がクローン間の細胞選別を促進することを実証します。 我々は、Tks5をサイレンシングすることによる浸潤足の除去を通じて、浸潤足を持つ細胞が浸潤足のない細胞よりも協調的な浸潤をリードし、それらの転移を可能にすることを実証した。

我々は、浸潤性 4T1 細胞がハイブリッド上皮/間葉状態にあるのに対し、非浸潤性 67NR 細胞は間葉性であるという以前に報告された観察を確認します 27、28、29。 浸潤足8に必要なTwistの発現は4T1細胞には存在するが、67NR細胞には存在しないことが以前に示されている41。 したがって、Twist 媒介 EMT は、4T1 細胞と 67NR 細胞の間の侵入スキルの違いの原因である可能性があります 41。 4T1 細胞は機能的な浸潤足を組み立てるが、67NR 細胞は組み立てないため、浸潤足の出現には EMT の完了ではなく、特異的な浸潤足を付与する EMT 軌道が必要とされると思われる。 私たちの結果は、上皮細胞 3,42 およびハイブリッド上皮/間葉細胞は、場合によっては間葉細胞より効率的に転移する可能性があるという最近の証拠と一致しています 43,44。

コア浸潤足構成要素であるコルタクチンと Tks5 を発現しているにもかかわらず、67NR 細胞はマトリックスを分解できません。 しかし、67NR 細胞は活性型 MMP-2 と MMP-9 を欠いています。これはおそらく、MMP-2 と MMP-9 の活性化を一般的に担当するプロテアーゼである MMP-14 (MT1-MMP としても知られています) が機能していない、または機能していないことが原因であると考えられます。細胞膜に送達されます45、46。

ここでは、癌における細胞選別の確立における差異的持続性と細胞 ECM 感受性の役割を明らかにします。 発生中の細胞選別に関する古典的な研究では、細胞選別は通常、細胞間接着の強さの違い 35 または収縮性の違い 47 に依存していることが示されています。 これらの見解に反して、我々は、4T1 細胞と 67NR 細胞が 2D ゼラチン層上、または 3D アガロース マトリックスに配置された場合に分類されなかったことを示します。 分類における運動性の差異の重要性は、組織のパターニング中 48 や、より指向性のある上皮細胞が組織の端に蓄積することが示された操作された乳管細管において以前に示唆されていました 49。 乳管の自己組織化中に、二成分細胞と ECM の相互作用 (オンまたはオフ) の存在が細胞選別を調節することが報告されています 36。 私たちの観察と同様に、Pawlizak et al. 最近、E-、N-、または P-カドヘリンを発現する乳房細胞株の選別は接着差仮説では説明できないことが実証されました 50。 興味深いことに、著者らは、細胞の選別には運動性が関与している可能性があると提案した。

われわれは、ECMに感受性の高い持続性の浸潤性細胞が非浸潤性でランダムに移動する細胞と混合しているスフェロイドでは、スフェロイドとECMの界面での浸潤性細胞の選別と蓄積が協調的浸潤に先立って行われることを発見した。 これは、リーダー細胞とフォロワー細胞の空間構成を調節するメカニズムを研究することの重要性を強調しています。 スフェロイドとマトリックスの境界面でのリーダー細胞の蓄積は、協力的な侵入の速度と効率を高める可能性があります。 これらの見解を裏付けるように、最近の研究では、細胞選別が乳房上皮細胞の基底押し出しに先行することが実証されました51。 重要なことは、細胞選別は触媒的であるかもしれないが、私たちのシステムにおける協力的な転移には必須ではないようであるということである。 4T1 Tks5-KD 細胞と Tks5-CTL 細胞の混合は協力的に転移しますが、選別はしませんが、4T1 細胞と 67NR 細胞の混合は選別しますが、協力的に転移はしません。

協調的浸潤の発見以来、異種の乳がん細胞集団が相互作用し、集団的に動員するメカニズムを解明するために重要な研究が行われてきた。 私たちの研究は、浸潤足の活性がリーダー細胞の表現型の決定因子であることを示唆しています。 我々は以前、細胞周期の G1 期もリーダー細胞のアイデンティティの決定要因であることを示しました 22。 この現在の研究と一致して、我々はまた、浸潤足が細胞周期の G1 期に豊富であることを証明しました 22。 別の研究では、侵入鎖をリードする細胞が後続の細胞と比較してより高い細胞内エネルギーを保有していることが明らかになりました 17。 総合すると、細胞周期、細胞内エネルギー、および浸潤足機能がリーダー細胞のアイデンティティの決定要因であると考えられます。 しかし、細胞周期、細胞内エネルギー、および浸潤足機能の間の相互作用は、細胞集団内のリーダーとフォロワーの出現という文脈ではまだ研究されていません。

要約すると、我々の研究は、がんクローン間の協力性​​が集団転移の効率的なメカニズムである可能性があることを示唆しています。 具体的には、浸潤足が協調的な転移を可能にし、非浸潤細胞の転移を可能にすることを実証します。 4T1 Tks5-KD と Tks5-CTL の協調的転移に関する我々の発見は、上皮細胞クラスターの播種に関する以前の実証と一致しています 3。 対照的に、67NR 細胞は 4T1 と混合しても協調的に転移しません。 さらに、MDA-MB-231 Tks5-KD (D2-KD) 細胞は、MDA-MB-231 細胞と協調的に転移しません。 これらの細胞株はどちらも E-カドヘリンを欠いているため、協調的な転移は E-カドヘリンに基づく強力な細胞間相互作用に依存していることが示唆されます。 興味深いことに、67NR 細胞と D2-KD 細胞の両方がそれらの浸潤性細胞を首尾よく追跡するため、3D スフェロイド アッセイにおける協力的浸潤にはそのような要件はありません。 おそらくその理由は、浸潤性リーダー細胞によって生成されるコラーゲンの変形が可塑性 (永久的) であり、細胞鎖または個々の細胞がそれらを通って移動できるためであると考えられます 39。 対照的に、リーダー細胞が血管壁に生じる変形は弾性的（一時的）であり、フォロワーはリーダーに対して強い細胞間接着を示した場合にのみ血管壁を横切ることができます。

私たちの発見は、がん細胞が協調的な転移に関与しており、それが単一細胞の転移よりも有害である可能性があることを示しています。 我々は、浸潤足を標的にすることが、個別に浸潤する細胞と集団的に浸潤する細胞の両方の転移を阻害する強力な戦略となり得ることを提案する。

マウス（ハツカネズミ）に関するすべての実験は、NIH の規制に従って実施され、テンプル大学 IACUC プロトコル番号 4766 によって承認されました。

回転楕円体イメージング デバイス (SID) は、前述のように製造されました 33。 簡単に言うと、ポリジメチルシロキサン (PDMS) ディスクをガラス底皿 (MatTek Corporation) に結合することによって SID を作成しました。 各 PDMS ディスクの直径は 17.5 mm で、個々のスフェロイドに適した直径 5.5 mm のウェルが 3 つ含まれています。

6 ウェル プレートを前述のようにゼラチンでコーティングしました 52。 簡単に説明すると、各ウェルを2.5%ゼラチン溶液で10分間コーティングし、続いて氷上で0.5%グルタルアルデヒド(Sigma-Aldrich)で10分間処理し、さらに室温で30分間処理した。 プレートを70%エタノールで滅菌し、その後50U/mLペニシリン-50μg/mLストレプトマイシン処理した。

同質遺伝子型マウス乳がん細胞株 4T1 および 67NR は、カルマノスがんセンターの Fred R. Miller 博士と UCSD の Jin Yang 博士から寄贈されました。 ヒト乳がん細胞株 MDA-MB-231 (HTB-26) は、American Type Culture Collection から入手しました。 MDA-MB-231-Dendra2-hTks5 KD 細胞株は以前に記載されており、継続的な 0.5 μg/ml ピューロマイシンおよび 500 μg/ml ジェネティシン圧力下で維持されました 13。 すべての細胞は、10% ウシ胎児血清 (FBS、Atlanta Biologicals) および 50 U/mL ペニシリン - 50 μg を添加したダルベッコ改変イーグル培地 [4.5 g/L D-グルコース、L-グルタミン] (DMEM、Gibco) で培養しました。 /mLストレプトマイシン(Gibco)。 細胞培養は 37 °C、5% CO2 で最大 60 日間維持されました。

4T1-mScarlet および 67NR-GFP 細胞株は、メーカーの説明書に従って、1:4 の比のプラスミド DNA:FugeneHD 試薬 (Promega) を使用してトランスフェクションし、続いて 500 μg/mL ジェネティシン (Fisher BioReagents) で選択することによって生成しました。それぞれ 3 μg/mL ピューロマイシン (MP Biomedicals)。 pmScarlet-H-C1 は Dorus Gadella から贈られたものです (Addgene プラスミド # 85043)。 pEGFP-puro は Michael McVoy から贈られたものです (Addgene プラスミド # 45561)。 MDA-MB-231-mScarlet 細胞株は、製造業者の指示に従って、pmScarlet-C1 プラスミドのエレクトロポレーション (Lonza) および 500 μg/ml ジェネティシンによる選択によって生成されました。 2 週間の薬剤選択後、細胞を選別し (BD FACSAriaIIμ、BD Biosciences)、高レベルの mScarlet または GFP を発現する部分集団を収集しました。

ノックダウン細胞株 Tks5-KD および -KD2、E-カドヘリン -KD1 および -KD2、およびノックダウン対照細胞株 Tks5-CTL、Ecad-CTL、および MDA-MB-231-mScarlet-CTL は、4T1 の形質導入によって生成されました。 -mScarlet、4T1、および MDA-MB-231-mScarlet 細胞株、それぞれ、mTks5 をターゲットとする shRNA を含むレンチウイルス粒子 (ウイルス粒子 3 個/細胞) (クローン ID: TRCN0000105733、CGTGGTGGTGTCCAACTATAA; クローン ID: TRCN0000105734、CCTCATACATTGACAAGCGCA)、hTks5 は前述の 13 、または E-カドヘリン (KD) (クローン ID: TRCN0000042581、CCGAGAGAGTTACCCTACATA; クローン ID: TRCN0000042579、CGGGACAATGTGTATTACTAT)、または pLKO.1-puro ベクター (MISSION ライブラリー、Sigma-Aldrich) 内の非ターゲティング shRNA (CTL)、および選択感染後 3 ～ 7 日後に 2 µg/mL ピューロマイシンを投与。 ウエスタンブロットを分析して、KD 効率を確認しました。 さらに、Ecad-CTL および Ecad-KD の画像は E-カドヘリンで免疫標識され、Cellpose を使用してセグメント化されました。 マスクを画像上に重ねて、セルあたりの積分密度を定量化しました。

クリスタル バイオレット染色を使用して、4T1 細胞株の増殖に対するマイトマイシン C の効果を評価しました。 簡単に説明すると、4T1 細胞を 6 ウェル プレートに播種し、翌日、培地を 0.5 μg/mL マイトマイシン C (DMSO に再懸濁、Cayman Chemical) を含む培地と交換しました。 2日後、細胞を冷PBSで洗浄し、氷冷100%メタノールで10分間固定し、25%メタノール中の0.5%クリスタルバイオレット溶液で室温で10分間染色した。 水道水で数回洗浄することにより過剰な染料を除去し、プレートを室温で一晩風乾した。 100%メタノールを使用して20分間染料を可溶化し、プレートリーダーで570nmで光学濃度を読み取った。 マイトマイシン C 処理細胞の 570 nm での光学密度は、DMSO 処理細胞の 570 nm での光学密度として報告されました。

ゼラチンを Alexa-405-NHS エステルで蛍光標識し、35 mm ガラス底ディッシュ (MatTek Corporation) を前述のように Alexa-405-ゼラチンでコーティングしました 31。 400,000 (4T1/67NR) または 300,000 (MDA-MB-231) 細胞をディッシュごとにプレーティングし、18 時間後に細胞を 4% パラホルムアルデヒド (Alfa Aesar) で 10 分間固定し、0.1% Triton X-100 (Calbiochem) で透過処理しました。 5 分間インキュベートし、PBS (Gibco) 中の 1% FBS/1% BSA (Sigma-Aldrich) で 3 時間ブロックし、抗 Tks5 抗体 (Millipore、MABT336) で 2 時間インキュベートした後、二次抗体および Alexa Fluor 633 ファロイジンとインキュベートしました。 （インビトロジェン）１時間。

サンプルは、60X 対物レンズ (UPLSAPO60XS、1.35 NA、Olympus) を使用してレーザー走査型共焦点顕微鏡 (FV1200、Olympus) で画像化されました。 スタックは 1 μm z ステップで収集されました。 マトリックスの劣化を定量化するために、フィジーでカスタム マクロを使用して画像を処理しました。 簡単に説明すると、スタックからのスライスを Max Intensity 法を使用して Z 投影し、続いて自動しきい値アルゴリズムを使用してゼラチン チャネルのシグナルをしきい値処理し、粒子分析ツールを使用して分解スポットの面積を測定しました。 視野全体の細胞密度の違いを考慮して、視野内の劣化の合計面積を、この視野内に存在する細胞の合計数で割りました。 F-アクチン染色を使用して細胞を計数しました。

6 ウェル プレートを 50 μg/ml ポリ-L-リジン (Sigma-Aldrich) で 20 分間コーティングし、風乾しました。 細胞を播種し、コンフルエントになるまで培養した後、10 μl ピペット チップを使用して単層全体に十字型の傷を作成しました。 サンプルは、LED ランプ (Excelitas Technologies)、Orca 16 ビット電荷結合素子カメラ (浜松)、自動 Z ドリフト補償 IX3-ZDC (オリンパス) を備えた広視野顕微鏡 (IX-81、オリンパス) で撮影されました。 、自動ステージ（Prior Scientific）、環境チャンバー（Live Cell Instrument）、および 10X 対物レンズ（MPlanFL N 10X、0.3 NA、Olympus）を使用します。 細胞の運動性を 10 分間隔で 48 時間にわたって記録しました。 手動細胞追跡は、Fiji53 を通じて TrackMate プラグインを使用して実行されました。 トラック番号、スポット座標、フレーム番号がエクスポートされました。 速度と持続性の計算は、カスタムメイドの Matlab コードを使用して行われました。

ゼラチン アイランドを生成するために、PDMS インサートを利用しました (回転楕円体イメージング デバイス (SID) の製造を参照)。 簡単に説明すると、35 mm ガラス底ディッシュ (MatTek Corporation) を 50 μg/ml ポリ-L-リジン (Sigma-Aldrich) で 20 分間コーティングし、風乾しました。 次に、PDMS リングをガラスの上に静かに置き、静かに押し下げて密封しました。 次に、直径 5.5 mm の各穴を、前述のように蛍光標識ゼラチンでコーティングしました 31 (2D ゼラチン分解アッセイを参照)。 4T1-mScarlet 細胞と 67NR-GFP 細胞を 1 対 1 の比率で各穴に播種しました。 細胞を1時間接着させた後、PDMSインサートをガラスから静かに剥がし、培地を皿に加えました。 最後に、24 時間後に細胞を 4% パラホルムアルデヒド (Alfa Aesar) で 10 分間固定しました。

サンプルは、pco.panda sCMOS カメラ (PCO) を備え、10 倍の対物レンズ (CFI Plan Fluor 10X、0.3 NA、Nikon) を使用した広視野顕微鏡 (Eclipse Ti2-E、Nikon) で画像化されました。 タイル (6 × 6) を取得して、ゼラチン島の表面全体を視覚化しました。 生細胞は、環境チャンバー (Tokai Hit) を使用して 10 分ごとに画像化されました。 ムービーには、DrawArrowInMovie Fiji プラグイン 54 を使用して注釈が付けられました。 2D 細胞-ECM 接着競合アッセイを定量化するために、ゼラチン アイランドから遊走した 4T1 および 67NR 細胞の数を数えました。 2D での細胞選別を定量化するために、ゼラチンでコーティングされた領域のみを利用し、同型近傍の数を数えました。

接触角の測定は前述のように実行されました 36。 簡単に説明すると、35 mm ガラス底ディッシュ (MatTek Corporation) を、前述の蛍光標識ゼラチン 31 または 50 μg/ml ポリ-L-リジン (Sigma-Aldrich) で 20 分間コーティングし、風乾させました。 細胞は、イメージングの前に 5 時間接着したままにしておきました。 近くの細胞と物理的相互作用がなかった孤立細胞を、環境チャンバー (In Vivo Scientific) を備えた 60 倍の対物レンズ (UPLSAPO60XS、NA 1.35、Olympus) を使用して、レーザー走査型共焦点顕微鏡 (FV1200、Olympus) で画像化しました。 1 μm の Z ステップ。 直交ビューを使用して、ECM とセルの本体の間の角度、つまり接触角を測定しました。

4T1 および 67NR 細胞株については、ハンギング ドロップ法により 3D スフェロイドを生成しました。 4.8 mg/mL メチルセルロース (Sigma-Aldrich)、20 μg/mL Nutragen (Advanced Biomatrix) を含む 40 μl 滴あたり 3000 個の細胞を組織培養皿の蓋上に置きました。 蒸発を防ぐために、蓋を注意深く裏返し、ＰＢＳで満たされた皿の底部リザーバー上に置いた。 あるいは、MDA-MB-231 細胞株の場合、エタノール中の 0.5% ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート) (Sigma-Aldrich) でコーティングした 96 ウェル V 底ディッシュで 3D スフェロイドを生成しました。 次に、50 μl の培地中の 5000 個の細胞を各ウェルに分配し、プレートを 1000 × g、4 °C で 20 分間遠心分離しました。 最後に、50 μl の Matrigel (Corning) を最終濃度 2.5% で各ウェルに添加しました。 スフェロイドを 37 °C、5% CO2 で 3 日間かけて形成し、30 μl の 5 mg/mL ラット尾コラーゲン I (Corning、代替ゲル化プロトコル) に包埋し、SID に配置しました。 コラーゲン I を 37 °C で 30 分間重合させた後、培養培地をディッシュに加えました。 薬物処理には、25 μM GM6001 (DMSO に再懸濁、Cayman Chemical)、10 μM Y-27632 (DMSO に再懸濁、Cayman Chemical) または 0.1% DMSO 対照を含む細胞培養培地を使用しました。

4T1-mScarlet 細胞が 67NR-GFP スフェロイドを取り囲む実験では、コラーゲンの重合前に、67NR-GFP スフェロイドを含むコラーゲン混合物に 4T1-mScarlet 細胞を 106 細胞/mL で添加しました。

馴化培地を使用した実験では、4T1-mScarlet 細胞をゼラチンでコーティングした 6 ウェル プレートに 2 × 106 細胞/ウェルで播種しました。 ウェル当たり２ｍＬの完全ＤＭＥＭを使用し、ゼラチン上にプレーティングされた４Ｔ１－ｍＳｃａｒｌｅｔ細胞からのならし培地を使用して、埋め込まれた６７ＮＲ－ＧＦＰスフェロイドを０日目から培養した。 2日ごとに馴化培地を交換した。

コラーゲンは、2 μg/ml の 405-Alexa-NHS エステル (Biotium) を使用して、以前に記載されているように 55 標識されました。

E-カドヘリンをブロックするために、5μg/mlのブロッキング抗体(MABT26、Millipore)を使用して細胞間接着を破壊した。 Ecad-KD スフェロイドは、前述のように生成されました 19。 簡単に説明すると、細胞をトリプシン処理し、完全 DMEM F12 培地 (5% ウマ血清、0.5 μg/ml ヒドロコルチゾン、20 ng/ml hEGF、10 μg/ml インスリン、100 ng/ml コレラ毒素) に 1.5 × 104 細胞/ml で再懸濁しました。 、１％ペニシリン／ストレプトマイシン）および０．２５％メチルセルロース（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）。 細胞懸濁液を非接着性丸底９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に２００μｌ／ウェルで播種した。 プレートを室温で 1000 rpm で 5 分間遠心分離し、37 °C、5% CO2 のオービタルシェーカー上に 2 時間置きました。 培地を、０．２５％メチルセルロース（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）および１％Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を含有する完全ＤＭＥＭ Ｆ１２と交換した。 インキュベーター内で 48 時間かけてスフェロイドを形成しました。

免疫蛍光標識は以前に記載されているように実行されました 33。 簡単に説明すると、埋め込まれたスフェロイドを 4% パラホルムアルデヒドおよび 0.5% Triton X-100 の PBS 溶液で 5 分間同時に固定および透過処理し、さらに 4% パラホルムアルデヒドの PBS 溶液で 20 分間固定し、1% FBS/1% BSA の PBS 溶液でブロックしました。シェーカー上で 4 °C、24 時間。 次に、埋め込まれたスフェロイドを抗コラーゲン I¾ (immunoGlobe、0207-050; 1 ～ 100)、抗 E-カドヘリン (Invitrogen、13-1900; 1 ～ 100)、抗 N-カドヘリン (BD Transduction Laboratories、 610920; 1 ～ 100）および抗 Tks5（Millipore、MABT336; 1 ～ 100）を 4 °C で一晩、二次抗体および Alexa Fluor 633 ファロイジン（Invitrogen; 1 ～ 250）とともにシェーカー上で室温で 1 時間静置しました。

回転楕円体は、10 倍の対物レンズ (UPLXAPO10X、0.4 NA、オリンパス) または 30 倍の対物レンズ (UPLSAPO30XSIR、1.05 NA、オリンパス) を備えたレーザー走査型共焦点顕微鏡 (FV1200、オリンパス) を使用し、3 ～ 5 μm の z ステップを使用して画像化されました。 総スフェロイド面積を定量化するために、スフェロイドを DAPI で標識しました。 画像はフィジーのカスタム マクロを使用して処理されました。 簡単に言うと、スライスは Max Intensity 法を使用して Z 投影され、核はフィジーの自動閾値アルゴリズムを使用して選択されました。 次に、粒子分析ツールを使用して核の総面積を測定しました。

E-カドヘリンシグナルを定量化するために、Max Intensity 法を使用して対象のスライスを Z 投影し、鎖または単一細胞を特定しました。 相対的な結合部/サイトゾル比については、鎖内の 2 つの細胞間の結合部を横切り、その中心を通る長さ 10 μm の線を描きました。 プロット プロファイル ツールを使用して、E-カドヘリンおよび F-アクチン チャネルの線に沿ったグレー値を測定しました。 0 および 5 μm のグレー値は、それぞれ「サイトゾル」および「結合」シグナルとして定義されました。

細胞の選別を定量化するために、フィジーでカスタム マクロを使用して画像を処理しました。 Z スライスの最大投影により細胞の位置にアーティファクトが導入されるため、回転楕円体エッジとコア コンパートメントに関しては、Z スタックの中央スライスのみを利用しました。 簡単に言うと、中央スライスが Z スタックから抽出され、フィジーの自動閾値アルゴリズムを使用して明視野チャネルで回転楕円体コアが選択されました。 次に、[測定] の [楕円のフィット] および [重心] オプションを使用して、回転楕円体コアの中心と回転楕円体コアの長軸の座標を抽出しました。 最後に、マルチポイント ツールを使用して、GFP + 細胞と mScarlet+ 細胞の座標を記録しました。 細胞選別は、回転楕円体の中心から細胞までの距離（図２ｃのｄ）として、回転楕円体の長半径（図２ｃのａ）を越えて定量化した。 この比率を「距離指数」（DI）と定義しました。 あるいは、Tks5-CTL（図6）または4T1野生型細胞（図S12）などの非標識細胞を含む混合スフェロイドの場合、DAPI染色を使用して細胞の座標を測定しました。 特定の追跡セルについて、ΔDI をその最終位置の DI から初期位置の DI を引いたものとして定義しました。

スフェロイドのライブイメージングは​​、細胞選別を分析するために縦方向（毎日）に、または細胞運動性を分析するために微速度撮影によって実行されました。 環境チャンバー（ライブセル装置）を備えた１０Ｘ対物レンズ（ＵＰＬＸＡＰＯ１０Ｘ、０．４ＮＡ、オリンパス）を使用する共焦点顕微鏡（ＦＶ１２００、オリンパス）を使用した。 細胞の運動性は、15 μm z ステップで 44 時間にわたって 10 分または 20 分間隔で記録されました。 コアコンパートメントとエッジコンパートメントの両方の細胞が見えるスライスのみを追跡に使用しました。 細胞追跡は、Fiji53 を通じて TrackMate プラグインを使用して実行されました。 スポット検出は、メディアン フィルタリングとサブピクセル位置特定を備えた LoG 検出器を使用して行われました。 次に、直線運動 LAP トラッカーを使用してスポットをリンクしました。 トラックは、トラック内のスポット数に基づいて、1 トラックあたり 5 スポット以上のカットオフでフィルタリングされました。 トラックは、TrackScheme ツールを使用して視覚的に検証され、必要に応じて修正されました。 最後に、新しいスポットを導入することで線路の隙間を埋めました。 新しいスポットの位置は、線形補間を使用して計算されました。 各トラックについて、元のスポットからスフェロイドとコラーゲン I の界面までの距離が測定され、この距離が ≤ 30 μm の場合、トラックはエッジとして分類され、それ以外の場合、トラックはコアとして分類されました。 トラック番号、スポット座標、フレーム番号がエクスポートされました。 距離指数の計算は、カスタムメイドの Matlab コード (ご要望に応じて入手可能) を使用して行われました。

個々の細胞の軌跡の座標は、各回転楕円体の原点を (0,0) とする粒子追跡によって取得され、デカルト {x,y} から {r,φ} 極座標系に変換されました。 次に、平均二乗変位 (MSD) を半径方向と角度方向で計算し、さまざまな回転楕円体およびさまざまな条件で実験を繰り返して平均しました。 次に、MSD データを両方向でべき乗則に当てはめました。

そして

ここで、 \(({r}_{0},{\phi }_{0})\) は、極座標系の各軌道の原点 \({\Gamma }_{r,\phi }\) に対応します。 ) はべき乗則の振幅に対応し、\({\alpha }_{r,\phi }\) はそれぞれ半径方向と角度方向の指数です。 MSD データは、Levenberg-Marquart アルゴリズムを使用して、間隔 [0, 3 h] の適合範囲でこれらのべき乗則に適合しました。 細胞の運動性は、α < 1 の場合は準拡散性、α = 1 の場合は拡散性、α > 1 の場合は超拡散性であることに注意してください。

半径方向では、動きが超拡散的であることが判明したため、次式で与えられる時間依存の実効拡散係数も計算しました56。

その結果

拡散性ではない動きの場合、時間に依存する \({{{{{{\rm{D}}}}}}}_{{{{{{\rm{eff}}} }}}}\left(t\right)\) は、同じ時点が比較に選択されている限り、正しい単位で拡散係数を推定し、一貫した方法で異なるデータセットを比較する唯一の方法です。

細胞をポリ-L-リジンでコーティングした皿に播種し、80％コンフルエンシーまで培養しました。 細胞を、プロテアーゼ阻害剤（コンプリートカクテル、Roche）およびホスファターゼ阻害剤（Haltカクテル、Sigma-Aldrich）を添加した氷冷RIPA溶解緩衝液（Teknova）中で回収した。 SDS-PAGE はサンプルあたり 20 μg のタンパク質で実行され、ポリフッ化ビニリデン膜 (Immobilen) に転写され、5% BSA/TBST で室温で 3 時間ブロックされ、抗 β-アクチン (Santa Cruz Biotechnology, sc-) とインキュベートされました。 47778; 1 ～ 500)、抗コルタクチン (Abcam、ab33333; 1 ～ 1000)、抗 E-カドヘリン (BD Transduction Laboratories、610181; 1 ～ 1000)、抗 FAK (Santa Cruz Biotechnology、sc-271126、1)抗リン酸 FAK (Tyr397) (Invitrogen、44625 G、1 ～ 100)、抗 N-カドヘリン (BD Transduction Laboratories、610920; 1 ～ 500)、および抗 Tks5 (Millipore、MABT336; 1 ～ 500) ) 5% BSA/TBST で 4 °C で一晩希釈した抗体。 次にメンブレンを、5% 無脂肪乳/TBST で希釈した HRP 結合抗マウスまたは抗ウサギ IgG (Cell Signaling Technologies; 1 ～ 5000) 抗体とともに室温で 1 時間インキュベートし、化学発光検出試薬を使用してタンパク質を可視化しました。 (WesternBright、Advansta) およびブロット スキャナー (C-DiGit、LI-COR)。

マウスに腫瘍を形成するために、200,000個の細胞をPBS中の20%コラーゲンI 100μlに懸濁し、7週齢の雌マウスの乳房脂肪体に同所的に注射した。 4T1 または MDA-MB-231 細胞の混合物を接種する場合、細胞比は 1:1、4T1:67NR では 1:300 でした。 腫瘍直径が 8 ～ 12 mm、4T1 および 67NR の場合は Balb/cJ マウスで 14 ～ 20 日、MDA-MB-231 の場合は SCID マウスで 8 ～ 10 週間に達した時点で、動物を屠殺し、腫瘍と肺を採取しました。 肺クローン原性アッセイ (https://doi.org/10.5281/zenodo.6639302) では、肺を細かく刻み、コラゲナーゼ IV 型/エラスターゼ カクテル (Worthington Biochemical) で消化し、70 μm メッシュで濾過しました。 次に、各肺からの細胞懸濁液を 2 つの組織培養プレートに分割しました。 Tks5-CTL細胞およびTks5-KD細胞の増殖のために、1つのプレートを6-チオグアニン(Cayman Chemicals)およびピューロマイシンの組み合わせとともにインキュベートした。 もう一方のプレートは、4T1 Tks5-KD 細胞のみの増殖には 6-チオグアニン、ピューロマイシン、ジェネティシンの組み合わせでインキュベートするか、MDA-KD 細胞の増殖には 0.5 μg/ml ピューロマイシンと 500 μg/ml ジェネティシン (Invitrogen) の組み合わせでインキュベートしました。 MB-231 D2-KD。 37 °C、5% CO2 で 14 日間放置した後、コロニーをメタノールで固定し、0.03% (w/v) メチレン ブルー (Sigma-Aldrich) を使用して染色し、カウント (4T1 および 67NR) するか、蛍光標識 (D2) を使用してカウントしました。 -K D）。

腫瘍のウェスタンブロットを行うために、Tks5-KD 腫瘍を採取し、細かく刻み、HBSS 中の新たに調製したコラゲナーゼ III 型 (ワーシントン生化学) 溶液で消化し、70 μm メッシュで濾過し、6-KD を補充した培地で 7 日間培養しました。チオグアニンとジェネティシン。 細胞を上記のように溶解した。

腫瘍切片を画像化するために、腫瘍を 4% PFA、4 °C で一晩固定し、氷冷 PBS で 1 時間洗浄し、30% スクロース溶液に移し、4 °C で一晩インキュベートし、包埋し、OCT で凍結し、6 で切断しました。 μmの厚さ。 67NR-GFP シグナルを増加させるために、混合 4T1-67NR 腫瘍を抗 GFP 抗体一次抗体 (ab13970、1 ～ 100) およびヤギ抗ニワトリ IgY H&L (Alexa Fluor® 488、ab150169) で標識し、核を DAPI で染色しました。 。

RStudio ソフトウェアを使用してすべての統計分析を実行しました。 各データセットの分布が分析され、正規性をテストするために Shapiro-Wilk 検定が実行されました。 正規分布データセットの場合、F 検定を実行して 2 つのデータセットの分散を比較しました。 F 検定の結果に基づいて、Welch 2 サンプル t 検定または 2 サンプル t 検定を実行して、2 つのデータセットの平均を比較しました。 非正規分布データセットについては、Wilcoxon 順位和検定を実行して 2 つのデータセットを比較しました。 特に明記しない限り、すべてのテストは対応のない両側基準を使用して実行されました。 すべてのデータは、中央値 (線)、25/75 パーセンタイル (ボックス)、最大値/最小値 (ひげ) を含む折れ線グラフまたは箱ひげ図として表されます。 統計的有意性は、*p < 0.05、**p < 0.01、および ***p < 0.001 として定義されました。 メトリクスと統計に関する追加情報は、ソース データ ファイルにあります。 すべてのデータはリクエストに応じて入手可能です。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

この研究中に生成または分析されたすべてのデータは、この公開記事およびその補足情報に補足データ 1 として含まれています。ソース データおよびムービーの凡例については、追加の補足資料の説明を参照してください。 プラスミド pmScarlet-H-C1 は Dorus Gadella (Addgene プラスミド # 85043) から贈られたもので、pEGFP-puro は Michael McVoy (Addgene プラスミド # 45561) から贈られたものです。 トリミングされていないウェスタンブロットは補足図で利用できます。 S13～S27。

現在の提出に関連するデータ処理と分析のためのすべてのコードは、https://github.com/tuzellab/cooperative_invasion および (https://doi.org/10.5281/zenodo.6639302) で入手できます。

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細胞選別の支援をしていただいたルイス・カッツ医科大学のフローサイトメトリー・コア、そして貴重な議論をしていただいたTemple Bioengineering および Fox Chase Cancer Center Biology のメンバーに感謝いたします。 資金は NIH R00 CA172360、R01 CA230777 (BG) および R01 GM121679 (ET) によって提供されました。 米国癌協会研究奨学金 134415-RSG-20-034-01-CSM (BG) および Conquer Cancer Now/Young Investigator Award (BG)。

ルイジアナ・ペリン

現在の住所: キュリー研究所、UMR144、パリ、フランス

米国ペンシルベニア州フィラデルフィア、テンプル大学生物工学部

ルイジアナ・ペリン、エリザベタ・ベロワ、バトゥヤ・バヤルマグナイ、エルカン・トゥゼル、ボジャナ・グリゴリイェヴィッチ

がんシグナル伝達およびエピジェネティクス プログラム、フォックス チェイスがんセンター、米国ペンシルバニア州フィラデルフィア

ボジャナ・グリゴリイェビッチ

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構想：LP、BG、データ収集：LP、EB、BB、BG、分析：LP、EB、BG、ET、監修：BG、執筆：LP、EB、BB、ET、BG

ボヤナ・グリゴリイェビッチへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Communications Biology は、この研究の査読に貢献してくれた Jing Yang、Feng Chiao Tsai、Díaz Begoña に感謝します。 主な編集者: Ruby Huang と Eve Rogers。 査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

ペリン、L.、ベロバ、E.、バヤルマグナイ、B. 他。 浸潤足は、乳がん細胞の共同的な浸潤と転移を可能にします。 Commun Biol 5、758 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s42003-022-03642-z

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受信日: 2021 年 6 月 16 日

受理日: 2022 年 6 月 28 日

公開日: 2022 年 8 月 1 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-03642-z

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