バイオセンサーを用いたフェニルケトン尿症の合成生細菌治療薬の改良

Nature Communications volume 12、記事番号: 6215 (2021) この記事を引用

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メトリクスの詳細

フェニルケトン尿症（PKU）患者では、酵素フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（PAH）の遺伝的欠陥により全身性フェニルアラニン（Phe）が上昇し、重度の神経障害を引き起こす可能性があります。 PKU の治療法として、胃腸 (GI) 管内から Phe を分解する大腸菌ニッスル (EcN) 株 SYNB1618 が、Synlogic の Synthetic Biotic™ プラットフォームの下で開発されました。 この臨床段階で改変された株は、Phe 代謝酵素フェニルアラニン アンモニア リアーゼ (PAL) を発現し、Phe の無毒性生成物トランス-シンナメート (TCA) への脱アミノ化を触媒します。 現在の研究では、変異体 PAL ライブラリーのバイオセンサー ベースのハイスループット スクリーニングを使用して、全細胞 PAL 活性を最適化することで、より強力な EcN ベースの PKU 株を生成します。 このスクリーニングから得られたリード酵素候補は、SYNB1618 に見られる追加の Phe 代謝機能とバイオセーフティ機能を含む染色体に組み込まれた株である SYNB1934 の構築に使用されます。 SYNB1934 は、SYNB1618 と比較して、生体内 PAL 活性が約 2 倍増加していることを示しています。

代謝性疾患であるフェニルケトン尿症 (PKU) は、フェニルアラニン ヒドロキシラーゼ (PAH) 酵素の欠如または機能の破壊を特徴とします。 PKU 患者はアミノ酸フェニルアラニン (Phe) を代謝できず、その結果全身に蓄積します。 Phe レベルの上昇は、治療せずに放置すると重度の神経合併症や障害を引き起こす可能性があります。 幸いなことに、PKU は 50 年以上にわたって新生児スクリーニングによって診断されており、生後 1 週間以内にこの病気が発見され治療されれば、重度の障害を軽減することができます 1。

Phe は必須アミノ酸であるため、患者における Phe の摂取量はタンパク質の食事制限によって制御できます。 しかし、食事療法の厳格な性質により、多くの患者は継続的な遵守を達成できません。 実際、成人になってから PKU 食を中止すると、実行機能の顕著な低下や大うつ病性障害と関連付けられています 2,3。 食事管理による Phe 摂取量の制御に加えて、2 つの承認された薬理学的治療オプションが存在します。 これらの選択肢の 1 つであるサプロプテリン二塩酸塩 (KUVAN、BioMarin Pharmaceutical) は、テトラヒドロビオプテリン (BH4) 応答性 PKU を持つ患者のための PAH 活性化剤です。 サプロプテリンは、追加の補因子を提供し、および/または変異型 PAH 酵素の生産的なフォールディングを促進する BH4 類似体です。 しかし、そのメカニズムにより、サプロプテリンは、PAH 活性が残存している PKU 患者のサブセット（PKU 人口の約 3 分の 1 と推定されている）にのみ有効です 4,5。 BH4 反応性の患者であっても、サプロプテリンが単独の治療法として使用されることはほとんどなく、並行した食事管理と組み合わせることが意図されています6。 もう 1 つの治療オプションであるペグバリアーゼ (Palynziq、BioMarin Pharmaceutical) は、ペグ化 Phe 分解酵素であるフェニルアラニン アンモニア リアーゼ (PAL) を全身注射することで構成されます。 ただし、この治療法には重度の免疫介在性副作用やアナフィラキシーの報告が報告されています 7,8。 年齢や遺伝的背景に関係なく、患者集団全体のニーズに応える、PKU 患者向けの安全な経口治療の選択肢が依然として必要とされています。

最近、消化管 (GI) 管内から治療機能を発揮できるプロバイオティック微生物の設計と工学への合成生物学の応用に大きな関心が集まっています9。 我々は以前、PKU10の治療のための生生物療法製品（LBP）SYNB1618の構築と特性評価を報告しました。 この遺伝子改変された大腸菌ニッスル 1917 株 (EcN) は、Photorhabdus luminescens の PAL (StlA) や Proteus mirabilis の L-アミノ酸デアミナーゼ (LAAD) などの酵素を発現します 11。これらの酵素は、食物および腸内再循環 Phe を体内で無毒な代謝産物に分解することを目的としています。消化管 (それぞれ桂皮酸 12、13 およびフェニルピルビン酸 14)。 SYNB1618 は、Pahenu2/enu2 マウス (PKU のマウスモデル) の血漿 Phe を有意に低下させるだけでなく、タンパク質ボーラスを投与された健康な非ヒト霊長類 (NHP) の血漿 Phe のスパイクを有意に防ぐことが報告されました。 SYNB1618 は、健康なボランティアと PKU 患者を対象としたランダム化プラセボ対照ファースト・イン・ヒト研究で評価され、この株は安全で忍容性が高く、血漿中の SYNB1618 特異的 Phe 代謝物が用量反応的に増加することが判明しました。尿15．

設計された LBP に対する熱意が高まるにつれて、そのパフォーマンスを向上させるために採用される方法論への関心も高まります。 大腸菌などの生物の場合、操作されたエフェクター機能の調節可能な発現を可能にする転写遺伝子回路を構築するためのモジュール部分が多数存在します9。 操作された菌株における異種遺伝子の発現を増強することは、活性を最適化するための直接的なアプローチであり、菌株の機能を最大化しようとする際に最初に対処すべき潜在的なボトルネックとなります。 遺伝子発現を超えて株の機能を強化するには、他の既存または進化する技術の適用が必要です。

バイオセンサーは、代謝およびタンパク質工学におけるスループットの制限を軽減する有望なアプローチとして浮上しています16。 増殖や蛍光などのレポーターシグナルを制御する場合、バイオセンサーを使用すると、これまでアクセスできなかったサイズのライブラリーを迅速に濃縮できます。 蛍光をレポーターとして使用し、蛍光活性化セルソーター (FACS) で細胞の表現型を解析すると、スクリーニング率は 1 時間あたり 107 に達する可能性があります 17。 現在まで、バイオセンサースクリーニングの取り組みは、フラボノイド抗酸化物質のナリンゲニンから希少な無毒糖であるプシコースなど、多様な代謝産物の産生を改善するために、自然界で見つかったアロステリック転写因子（aTF）の導入に焦点を当ててきました18、19、20、21、22、23。 。 aTF は新規代謝物に応答するようにうまく操作されていますが 24、25、26、我々の知る限りでは、市販株または治療用菌株を改善するための操作された aTF の使用を説明する公表された報告はありません。

この研究では、我々はまず、PALによるPhe異化の産物であるトランスシンナメート（TCA）の存在を感知して応答するようにaTFを設計した。 このバイオセンサーをスクリーニングと選択の両方の手段として使用し、全細胞活性を高めるための、LBP の PAL である StlA の指向性進化について説明します。 重要なのは、スクリーニングと選択を EcN で実行できるため、PAL 活性の増強が治療上関連する菌株との関連で評価される可能性があることです。 候補 PAL 変異体を使用して、第 2 世代 PKU 治療株 SYNB1934 を構築しました。この株は、インビトロおよびインビボで SYNB1618 を上回る性能を示すことが示されました。

PAL は、酸素、酸化還元等価物、補因子に依存しない比較的単純な酵素です 27。 ただし、細胞全体の状況では、PAL 活性は、細菌の代謝活性 (Phe を細胞内に、または TCA を細胞外に送り出すため)、外部 pH、または最終生成物の阻害など、多数の生理学的または環境的要因によって影響を受ける可能性があります。 予備研究では、菌株の活性が PAL 発現によって律速されるかどうかを判定することを目指しました。これは、菌株を最適化するための簡単な方法を提供するためです。 ただし、TCA産生はPAL発現の増加とともに頭打ちになりました（補足図1）。 したがって、私たちは全細胞形式での PAL 酵素自体の発現ではなく、パフォーマンスの最適化に重点を置きました。

Phe 分解 (TCA 生成) を改善するための高複雑性 PAL ライブラリーのスクリーニングを可能にするために、Zymergen 独自のセンサー エンジニアリング プラットフォームを使用して、特定の TCA 応答性バイオセンサーが設計されました。 TCAが存在しない場合、改変されたaTFは、蛍光レポータータンパク質（緑色蛍光タンパク質、GFP）をコードする遺伝子（図1aではgfpと標識）の発現を抑制する。 TCAがシステムに導入されると、抑制が解除され、gfpが発現します（図1a）。 このセンサー システムは、高コピー プラスミドとして野生型 EcN バックグラウンドに形質転換され、低コピー コンストラクトから発現された、初期の工学的取り組みによる PAL 変異体のラダーによって生成された TCA へのランク付けされた GFP シグナル読み出しを実証しました (図.1b)。 実証の目的で、図1bの各株を試験管内で別々に培養し、飽和時にフローサイトメーターで細胞ごとのGFPシグナルを分析しました。 この株ラダーアプローチは、プールされたライブラリーで観察される可能性のある株クロストーク（例えば、改良された生産表現型によって生産されるバルク培地中のTCAに応答する低TCAプロデューサー）を考慮していません。 以下でさらに詳しく説明する、複雑性の高いプールされたライブラリの大幅な濃縮は、マイクロ流体ベースのワークフローを使用して達成されました（図1c;モック対上位1％ p < 0.0001、モック-モック対上位1％-上位1） % p < 0.0001、および上位 1% から上位 1% への追加の濃縮 - 上位 1% p < 0.0001、ダネットの T3 多重比較検定を使用したウェルチの分散分析 (ANOVA) 検定)。

a バイオセンサーによって調節されるレポーター発現の概略図。 TCAが存在しない場合、アロステリック転写因子（aTF、図中の標識センサー）はDNAオペレーター部位に結合し、緑色蛍光タンパク質（GFP）をコードするレポーター遺伝子gfpの発現を妨げます。 PAL 活性は l-Phe を TCA に変換します。 TCAはセンサーaTFに結合し、構造変化を引き起こしてDNA結合を緩和（抑制）し、レポーター遺伝子の発現を可能にします。 記号と略語: フェニルアラニン (l-Phe、黄色の黒丸)、トランス桂皮酸 (TCA、オレンジ色の白丸)、PAL (フェニルアラニン アンモニア リアーゼ)。 b 上: 野生型 StlA 活性に対して正規化された 6 つの StlA PAL バリアントの全細胞活性 (「方法」を参照、プレートベース) (フォールドオーバー野生型、FOWT、野生型値はソース データで確認できます) 。 n = 2 の生物学的複製、個々のデータ ポイントが示されています。 下: stlA (StlA をコードする遺伝子) バリアント発現、センサー応答、および gfp (GFP をコードする遺伝子) 発現を同時に伴う飽和まで増殖させた後の、上のパネルからのバリアントの細胞ごとの GFP ヒストグラム。 色はグラフ間で一貫しています。 n = 50,000 個の細胞を分析した株あたり 1 つの代表的な培養物。 c 設計された PAL ライブラリの強化デモンストレーション。 さまざまな分類集団からの FOWT アクティビティを示す箱ひげ図と、クローン データ ポイント。 ボックスは第 1 四分位から第 3 四分位まで広がり、中心線は中央値を示します。 上ヒゲと下ヒゲは、それぞれボックスの境界の四分位範囲の 1.5 倍以内の最大点と最小点まで伸びます。 ひげの外側のデータ ポイントは外れ値とみなされます。 分類/対照の説明: 野生型、野生型 StlA を含む EcN、n = 12 の野生型生産値の平均に正規化された 12 の生物学的複製。 モック、細胞サイズと GFP ベースのゲーティングなしのダブレット除外に基づいてソートされたライブラリ、ソートされたプールからの n = 90 の独立したコロニー。 上位 1%、上位 1% の最も明るい細胞の選択も細胞サイズとダブレット排除に基づいてゲート処理され、選別されたプールからの n = 90 個の独立したコロニー。 モック-モック、モック集団をセンサーで新鮮な EcN バックグラウンドに再変換し、GFP 選択なしで 2 回目のモックソート、ソートされたプールからの独立したコロニー n = 90。 上位 1%-上位 1%、上位 1% 集団をセンサーで新鮮な EcN バックグラウンドに再変換し、上位 1% の最も明るい細胞を選別しました。選別されたプールからの独立したコロニー n = 90 個。 P 値は、Welch の ANOVA 検定と Dunnett の T3 多重比較検定を使用して計算されました。

クロストークは、TCA などの細胞膜を通って拡散または輸送される代謝産物の改善された生産表現型を単離するための選択技術の展開において一般的な問題です。 Flachbart ら 18 は、培養物を希釈し、培養時間を短縮してバルク培地中の TCA の蓄積を最小限に抑えることにより、エラーが発生しやすい 2.3 × 106 メンバーのライブラリーから、大腸菌由来のネイティブ TCA 応答性活性化因子 HcaR。 小分子の拡散を最小限に抑える別のアプローチは、単一の変異体をフッ素化オイルまたはゲルビーズにマイクロ流体的にカプセル化し 19,28,29 、その後液滴を分別する 30 ことですが、これにはスループットが犠牲になります。 油中水滴の生成は 1 秒あたり最大 10,000 滴の頻度に達する可能性があります 30 が、油中水滴選別技術は一般に 1 秒あたりわずか数十から数百の液滴の速度を確実に達成できます 19,30。 これは、油中水滴を第 2 水相にカプセル化して (つまり、水中油中水滴、別名ダブルエマルション)、市販の FACS28 で分別することで、1 秒あたり約 1,000 滴まで増やすことができます。しかし、ダブルエマルジョンプロセスは技術的に難しく、選別中に不安定になったり沈降したりする傾向があります。

現在の研究では、液滴インキュベーションの拡散緩和と、ポップ アンド ソート (図 2) と名付けたワークフローにおける FACS での細胞選別のスループットと容易さを組み合わせています。当社のセンサー技術の表現型関連性。 PAL 変異体はセンサー システムを保持する同じ EcN 株内で発現されたため、プロデューサーと専用センサー細胞の共培養システムの場合のように、GFP 応答は液滴ではなくプロデューサー細胞自体に関連付けられています 19,29。 ポップアンドソート手法を使用した場合（補足図2b;モックモック対上位1％-上位1％ p = 0.0007、ダネットのT3多重比較テストを使用したウェルチのANOVAテスト）と飽和状態から直接ソートした場合と比較して、大幅な濃縮が達成されました。液体培養（補足図2a; p = 0.1408）。

高コピーセンサーシステムプラスミド（緑色蛍光タンパク質GFPをコードするaTF抑制gfp遺伝子を有する操作されたaTF発現）および低コピー誘導性stlA変異体発現プラスミドのライブラリーを有するEcN細胞をプール内で一緒に増殖させた。 このプール内のさまざまなセルには、固有の stlA 配列が含まれています。 富栄養培地での前培養ステップに続いて、細胞を洗浄し、センサースクリーニング用に適合した M9 最少グルコース培地に再懸濁します。これにより、同時に stlA 発現が誘導され、基質 Phe が提供されます。 この段階で、細胞は OD600 まで希釈され、最大 1 細胞/液滴のロードとなります。 これらの培地中で希釈され、洗浄された細胞は、フッ素系界面活性剤を含むフッ素化オイル中で液滴を生成するための水相として機能します。 セルのロードはポアソン分布に従うため、上に示したように、時間 0 では一部の液滴は空になり、一部には複数の細胞/遺伝子型が含まれます。 ロードされた液滴は飽和するまで約 16 時間インキュベートされ、その時点で液滴ごとに多くの細胞が存在し、これらの細胞は TCA とその TCA 生成と相関する細胞ごとの GFP シグナルを生成します。 GFP シグナルは細胞自体に関連付けられているため、標準的な技術を使用してエマルションを破壊し、FACS 上で細胞を直接選別して目的の表現型を得ることができます。 レシピ、材料、プロトコルの詳細については、「メソッド」を参照してください。

本明細書に記載のポップアンドソート濃縮では、細胞を油中水滴中に約１細胞／液滴でマイクロ流体的にカプセル化した。 液滴は、カプセル化された培養物が飽和するまで、当社の培地および増殖条件下で約 16 時間インキュベートし、その時点でエマルジョンが破壊されました (方法)。 細胞を含む水層は油から分離され、標準プロトコルを使用して FACS で直接分類できました。 上記の超ハイスループット スクリーニング アプローチにより、計算によって設計された変異の 100 万を超えるメンバーの組み合わせライブラリをスクリーニングすることができました。

StlA の相同性モデルは、RosettaCM32 を使用して構築され (「方法」を参照)、活性部位残基を同定するために使用されました。 StlA 活性を向上させるために、活性部位の周囲の位置が変異の標的とされました。 活性部位内およびその周囲の突然変異によって導入された不安定性を補うために、系統発生分析 (位置特異的スコアリング マトリックス 33; PSSM) および共進化分析 (GREMLIN34) を実行して、好ましい残基を示唆しました (方法を参照)。 図3aに示すように、PSSMおよびGREMLINの進化分析では、StlA全体に広く分散した安定化変異が導入されています。

関心のある位置は、RosettaCM を使用して StlA に対して生成された相同性モデル上で強調表示されます。 活性部位残基は赤色で強調表示されます。 a ライブラリ構築中のコンビナトリアル突然変異誘発の標的となる位置。 ライブラリテンプレート内で突然変異した位置 (「方法」を参照) は緑色で強調表示され、コンビナトリアル突然変異誘発中に標的となる追加の突然変異はピンク色で表示されます。 b トップヒットの位置が変更されました。 最終的な SYNB1934 PAL バリアントで変異した位置は黄色で強調表示され、他の上位ヒットで変異した位置 (c の特別なマーカーで示され、補足で詳細を示します) は青色で表示されます。 c 系統樹は、Blosum62 置換行列 57 を使用してすべての配列間の距離を計算し、Biopython 58,59 の近隣結合によってツリーを構築することによって生成されました。 色は野生型に対して正規化された活性レベル (FOWT) を示します。 マーカー: 四角 = S92G_H133F_A433S_V470A、ひし形 = S92G_H133M_I167K_L432I_V470A、x = A93C_H133F_T322W_Y437N、星四角 = I28R_S92G_H133F_V470A、大きな円 = S92G_H1 33F_R185E、六芒星 = S92G_F109A_H133M_T503E、野生型 = 砂時計。 他のすべての一意のバリアントは小さな円で表示されます。

「方法」に記載されているように、PCRベースのアプローチを使用して、設計された変異を野生型StlAおよび3つの改良型StlAバリアントに導入しました（補足図3およびテンプレートの起源については周囲のテキストを参照）。 構築されたプラスミド ライブラリーは、センサー システムを含む EcN に形質転換され、ポップ アンド ソート戦略を使用した細胞ソーティングのために準備されました。 液滴中でのインキュベーション後、FACS によって細胞を選別し、上位 1% の最も明るい細胞を収集しました。 得られた集団は、90 クローン変異サブサンプルの TCA 産生中央値の増加を示し、低活性変異の大部分が欠如していました。 以前の上位 1% 集団の上位 1% を分離するポップ アンド ソートの 2 回目のラウンド (図 1c の上位 1%-上位 1%) により、集団は野生型と比較して中央値 > 25% 向上するまでさらに濃縮されました。誤検知もさらに少なくなります。 上位 1% および上位 1%-上位 1% プールは両方とも、モックソートされた対照と比較した場合、有意な濃縮を示しました (p < 0.0001、ダネットの T3 多重比較検定を使用したウェルチの ANOVA 検定)。

濃縮後、「方法」に記載されているように、全細胞活性のプレートベースの評価のために約 1500 クローンが選択され、改良された変異体の配列が決定されました。 最初の in vitro アッセイと in vitro シミュレーション (IVS) GI モデル実験の両方における多様な配列 (図 3c) と活性レベルに基づいて、6 つの異なる PAL 変異体が特に興味深いものでした (図 3b で強調表示されている位置、配列、および活性)補足表 1)。 図3cの系統樹は、これらの変異体が3〜5個の置換により野生型からどのように分岐するかを示しています。 6 つの変異体はすべて、133 位でヒスチジンからフェニルアラニンまたはメチオニンへの変異を共有しており、これにより活性部位近くの酵素のパッキングが増加し、活性の増加に関連しています。 野生型酵素のヒスチジンは、A129 からのカルボニル酸素を妨害することによって、関連するヘリックスを歪める可能性があります。 上位 6 つの変異体のうち 5 つには、ヘリックスの C 末端部分に位置する S92G 変異も含まれており、カルボニル酸素の水素結合を妨害することで柔軟性を高める役割を果たしている可能性があります。 S92G は活性部位の近くに位置するため、基質および/または生成物の結合と放出に影響を与える可能性があります。 これらの突然変異は、ツリー内の距離によって示されるように、サイズと電荷に関してさまざまな追加の置換と組み合わされます（図3c）。 追加の突然変異の潜在的な影響に関するさらなる推測は、補足表 2 に記載されています。

細胞は消化管を通過する際にさまざまなpH条件に遭遇する可能性があり、野生型PALを発現するEcNの細胞全体の活性は環境pHに強く依存することが観察されています（図4a）。 したがって、我々は、進化した PAL 酵素を発現する細胞が、pH の変化にさらされたときに野生型 PAL と同様の活性プロファイルを示すかどうかを確認しようとしました。 全体的な活性の低下という一般的な傾向は、テストしたすべての変異体で低いpHでも依然として観察され（補足図4a〜d）、よりアルカリ性のpHでは活性が改善されました（補足図4d）。 pH 5ですべての変異体の活性が全体的に低下したにもかかわらず、ほとんどの株は、少なくとも後の時点では依然として野生型を上回る改善を維持しました（図4b、補足図4e）。 ただし、バリアントA93C_H133F_T322W_Y437N（株ID EP2495）は、この条件下ではうまく機能せず、4時間で平均FOWT < 1（図4b）、より早い時点ではさらに深刻な活性低下（補足図4e）でした。この亜種についてはさらなるテストを実施しませんでした。

a pH 5、6、7、または 8 での 0.5 時間、1 時間、1.5 時間、2 時間、または 4 時間後の野生型 StlA による EcN の全細胞 TCA 生成。n = 3 の生物学的複製、個々のデータ ポイントを示す。 b pH 5、6、7、または 8 で 4 時間後の全細胞 PAL 活性は、野生型 StlA 活性に対して正規化されました (野生型、FOWT の倍数)。 n = 3 生物学的複製 ± sd c pH 7 で 4 時間後の全細胞 PAL 活性、pH 処理なしでアッセイ (対照)、または pH 5 で 1 時間インキュベート後 (pH 処理)、野生型 StlA 活性 (FOWT) に対して正規化）。 n = 3 生物学的複製 ± sd X 軸ラベルは株 ID、PAL 変異体を含む EcN を指します。 EP2315: 野生型 StlA、EP2516: S92G_H133F_A433S_V470A、EP2525: S92G_H133M_I167K_L432I_V470A、EP2495: A93C_H133F_T322W_Y437N、EP2502: I28R_S92G_ H133F_V470A、EP2528: S92G_H133F_R185E、EP2526: S92G_F109A_H133M_T503E。 追加の時点と正規化されていない TCA 生産データについては、補足図 4 および 5 を参照してください。

酸ストレス後の株の活性の再開を評価するために、細胞を最初にpH 5の培地に37℃で1時間曝露し、次に中性pHでの活性をアッセイしました（図4c、補足図5）。 pH 5でアッセイした場合に観察された非常に低い活性（補足図4a）とは対照的に、細胞はpH 5培地への1時間の曝露から回復することができ、対照細胞と同様の活性を示しました（図4c、補足図5a）。 ）。 すべての株は、pH 5に曝露した後も野生型StlAコントロールを超える改善を保持しました（図4c、補足図5b）。

2 つのバリアント、S92G_H133F_A433S_V470A および S92G_H133M_I167K_L432I_V470A は、これらの pH テストの両方で特に優れた性能を示し、中性 pH で最高の活性を示しました。 これら 2 つの変異体のそれぞれを含む EcN と野生型 PAL コントロール用に細胞溶解物を調製しました。 総タンパク質含有量の正規化後、両方の変異体からの溶解物は、野生型 StlA と比較して Vmax および KM 値の大幅な増加を示しました (EP2315 対 EP2516 では Vmax p = 0.0058 および KM p = 0.0023、EP2315 では Vmax p = 0.0135 および KM p = 0.0008)対 EP2525、不等分散の両側 t 検定に基づく; 表 1)、ただし、Vmax または KM に関して 2 つのバリアント間に有意差はありませんでした。

特徴付けられた 2 つの主要な PAL 変異体の間には識別可能な差異はありませんでしたが、S92G_H133M_I167K_L432I_V470A 変異体（以後 mPAL（変異型 PAL）と呼ばれます）が、ヒトへの投与に適した EcN ベースの生生物療法株である SYNB1934 を構築するために選択されました 9。 この変異体は、輸送中に細胞が溶解した場合に最終的に投与対象の食事性 Phe 負荷に寄与する可能性がある追加の Phe を組み込んでいないため、S92G_H133F_A433S_V470A よりも選択されました。 上述の S92G および H133M 変異に加えて、変異体には I167K、L432I、および V470A が含まれます。 補足表 2 で詳しく説明する理由により、L432I は基質の結合/放出に影響を与える一方、I167K と V470A は酵素の安定化に役割を果たしている可能性が高いと考えられます。 この株には、染色体に組み込まれたmPALをコードする遺伝子の複数のコピーが含まれており、生物学的封じ込めの目的で、必須の細胞壁成分であるジアミノピメリン酸塩の栄養要求性を生成するdapA遺伝子の変異が含まれています（図5a）。 SYNB1934 は、SYNB1618 と同じ補助 Phe 分解コンポーネント、つまり高親和性 Phe トランスポーター PheP および代替 Phe 分解酵素 LAAD10 を発現するように操作されました。 SYNB1618 の場合と同様、SYNB1934 の操作中に使用されたすべての抗生物質耐性遺伝子は株構築の完了時に除去されました。

最適化された PKU 株の活性を SYNB1618 と比較します。 a SYNB1934 細菌の概略図は、mPAL、PheP、LAAD をコードする遺伝子、および dapA 遺伝子の欠失を含む、主要な操作要素を示しています。 b 腸内環境の in vitro シミュレーションで、2.5 × 109 個の再懸濁凍結乾燥 SYNB1618 細胞と SYNB1934 細胞の TCA 産生を測定しました。 n = 3 の独立した生物学的トリプリケート±sd c および d NHP 被験者に 5 g ペプチドおよび 0.25 g d5-Phe ボーラスを経口投与し、続いて 1 × 1011 個の再懸濁凍結乾燥 SYNB1618 または SYNB1934 細胞を投与しました。 株特異的バイオマーカー TCA および d5-TCA の血漿曲線下面積 (AUC) が表示されます。 c については、グループあたり n = 18 人の生物学的に独立した NHP 被験者±標準誤差。各比較について、対応のない両側 t 検定を使用してデータを分析しました (p < 0.0001)。 クレアチニンに対して正規化された尿中ｄ５−ＨＡ濃度（ｄ）については、ＳＹＮＢ１６１８治療群ではｎ＝１８、ＳＹＮＢ１９３４治療群では１７±ｓｅ（ＳＹＮＢ１９３４治療群の１つのＮＨＰは実験中に尿サンプルを採取できなかった）。 データは、ウェルチ補正を備えた対応のない両側 t 検定を使用して分析されました (p = 0.0184)。

SYNB1934 は、完全に制御された発酵槽システムで高細胞密度まで増殖および誘導され、その後、洗浄、濃縮、再配合、および凍結乾燥が行われました。 このプロセスは、人間への投与を目的とした医薬品の製造をシミュレートします。 凍結乾燥した SYNB1934 と SYNB1618 の両方からの再懸濁物質は、蛍光色素排除アッセイで測定したところ、高い生存率を示しました (補足表 3)。 in vitro GI シミュレーションでは、再懸濁した SYNB1934 は、SYNB1618 と比較して約 2 倍の TCA 産生速度の有意な増加を示しました（図 5b; 一元配置 ANOVA とそれに続く Tukey の多重比較検定、p < 0.001）。

SYNB1934 と SYNB1618 の in vivo 活性を比較するために、次に NHP 研究に移りました。 我々は以前、血漿TCAを遺伝子操作株のPAL活性を追跡するためのユニークな株特異的バイオマーカーとして使用できることを報告した。 野生型 EcN の投与では、この代謝産物は検出されませんでした 10。 ペプチド (ペプトン) および重水素化 Phe (d5-Phe) の経口ボーラス投与後、SYNB1934 を投与された動物は、SYNB1618 を投与された動物と比較して、TCA および d5-TCA の両方への血漿曝露の有意な増加を示しました (5.4 ± 1.0 vs 2.9 ± 0.9)。 TCAについてはそれぞれmM * h、d5-TCAについてはそれぞれ8.7 ± 2.0 vs 4.6 ± 2.0 mM * h; se;図5c)。 さらに、in vivo で菌株によって産生される TCA は肝臓酵素によって定量的に馬尿酸 (HA) に変換され、尿中排泄の対象となります 10,35。 血漿 TCA とは異なり、尿中 HA は霊長類の尿に含まれる一般的な代謝産物であり、重大なバックグラウンド レベルをもたらします 10,35,36。 しかし、代謝トレーサーとして経口 d5-Phe を使用すると、特に操作された菌株に起因する尿中 HA 排泄量の計算が可能になりました。 それは、HA に代謝されて排泄の対象となる芳香族化合物は数多くありますが、Phe はその中に含まれず 10、したがって経口 d5-Phe から尿中 d5-HA への唯一の代謝経路は d5-TCA を経由するためです。 PAL によって製造された中間体。 投与後 6 時間の時点で、SYNB1934 を投与された動物の尿中 d5-HA 濃度は、SYNB1618 を投与された動物の尿中 d5-HA 濃度よりも 2 倍以上高かった（534.4 ± 107.0 対 249.1 ± 25.1 μg d5-HA/mg クレアチニン、参考；図.5d）。

PKU は通常、食事制限によって管理されますが、これは患者にとって大きな負担となります。 多くの場合、不適切な食事管理は生活の質の低下につながる可能性があります。 Engineered Synthetic Biotic™ 医薬品は、PKU を含むさまざまな代謝状態に対して、安全で忍容性があり、可逆的な経口投与による治療の可能性をもたらします。 EcN は、Synthetic Biotic™ 株開発のための理想的な細菌シャーシとして選択されました。 1917 年に発見され、炎症性腸疾患や過敏性腸症候群など、さまざまな消化器疾患の治療に人々で使用されてきました 37,38。 EcN は腸上皮と相互作用して抗炎症活動を刺激し、バリア機能を強化および維持することも報告されています 39。 重要なことに、EcN は、健康なヒトにおいて経口投与後、長期的な定着を示さない 40。 細菌の滞留時間の制限と生体内複製は、従来の大分子および小分子治療薬と同様の予測可能かつ再現可能な薬理学的特性を可能にする特性です9。 遺伝子操作された株に栄養要求性を含めることは、排泄後の環境での増殖を制限するだけでなく、予測可能な結果を​​さらに確実にするための保護手段として機能します。

この研究は、臨床 PKU 治療株の Phe 分解酵素 PAL を改善するための操作された aTF バイオセンサーの適用に焦点を当て、その後、改良された生生物療法薬 SYNB1934 の開発と前臨床試験が行われました。 バイオセンサー制御の蛍光読み出しにより、研究者は 1 日で何百万もの遺伝子型の表現型を解析できます 16。 しかし、歴史的には、生産性の高い株と低い株の間のクロストークにより、生産性を向上させるための効果的な濃縮を達成することが困難でした18。 ここでは、FACS によって液滴全体ではなく個々の細胞を選別しながら、インキュベーションステップに油中水型エマルジョンを使用して拡散を軽減する技術的に簡単な方法であるポップンソートを紹介します。 ポップアンドソート法と当社の人工バイオセンサーを使用して、100 万を超えるメンバーライブラリをスクリーニングして全細胞 PAL 活性を向上させ、活性が向上した変異体を特定しました。 改良された治療用菌株で使用された mPAL には、野生型酵素と比較して 5 つの変異が含まれており、そのうち 3 つは活性部位近くを標的としており、基質の結合/放出に役割を果たすと予想され、そのうち 2 つはおそらく安定させる効果があります。

インビトロ細胞溶解物実験では、mPAL は KM と同様に Vmax の大幅な増加を示しました。 最終的な LBP の発現と活性をできるだけ忠実に模倣するために、酵素ライブラリーの構築にはタンパク質タグは含まれませんでした。 細胞溶解物の動態解析では、報告されている Vmax 値における酵素濃度から kcat を分離することはできませんが (表 1 を参照)、総タンパク質含有量に対する正規化は、治療株の直接比較がどのように行われるかをよりよく表しています。実行される。 注目すべきことに、より高いKMは、低いKM（酵素に対する基質のより高い結合親和性）が、基質Pheと構造的に非常によく似ている生成物TCAによるより深刻な阻害と相関する可能性があるというプロジェクト全体の仮説と一致しています。 野生型 StlA および mPAL における阻害の特徴付けはこの研究では行われませんでしたが、TCA によるフィードバック阻害は、速度論的に特徴付けられた他の多くの PAL に共通の形質であり 41、42、43、44 であり、観察された活性の増加に基づいて StlA について仮説が立てられています。全細胞と比較した細胞ライセート中の(補足図1)。

さまざまな pH にさらされると、間違いなくヒトの胃腸管を通過する菌株に遭遇するでしょう。 これが株の活動に及ぼす影響は、最近 SYNB161845 について機械的にモデル化された 1 つのパラメーターであり、今後の研究では SYNB1934 についても同様のモデル化を行うことを目指しています。 この研究で特定されたすべての PAL 変異体は、環境 pH の変化に応答してほぼ同様の全細胞活性パターンを示しましたが、ほとんどの改良された変異体は依然として同じ条件下で野生型 PAL を上回る活性の増加を示しました。 一般に、PAL 酵素は塩基性範囲に最適 pH があると報告されています 43、46、47、48 が、我々は、これらの研究中にテストされた環境 pH 範囲に関係なく、大腸菌は回復して細胞質 pH を中性付近に維持すると推測しました 49。 しかし、pHが低下すると、膜透過性の増加とTCAなどの有機酸のサイトゾル蓄積が予想され、その結果、PALのフィードバック阻害が増加する可能性があります。 今後の研究は、低pHで観察される全細胞PAL活性の低下の原因を解明することを目的とし、酸性条件下での超ハイスループットスクリーニングに対応したセンサーアプリケーションの開発が正当化される可能性がある。 中性 pH で行われたこの研究で行われたスクリーニングでは、pH 耐性が大幅に改善された変異体を特定できないことは、指向性進化の第一法則としてよく呼ばれるもの、つまり「スクリーニングしたものは得られる」50 と一致しています。 スクリーンは、異なる pH、温度、浸透圧強度などでの活性など、目的の特性を強化するために適宜適応させることができます。とはいえ、pH 変化に対するリード PAL 変異株の応答には、表現型上の微妙な違いがいくつかありました。 低 pH では野生型酵素よりも活性が大幅に低下する変異体、または pH が上昇するにつれて野生型酵素を上回る活性の変化率の増加を示す変異体が観察されました。 他の変異体は、環境の pH に関係なく、野生型酵素と比較して活性が同じ倍の向上を示しました。 これらの結果は、プールされた 100 万を超えるメンバー変異体ライブラリーに含まれる多様性を強調しており、適切なスクリーニング/センサーと組み合わせると、代替の望ましい酵素特性の選択に迅速に再展開できる。

第 1/2a 相臨床試験では、SYNB1618 が健康なボランティアと PKU 患者の両方のヒト腸内で、用量反応的に Phe を消費し、予想される非毒性代謝物に変換することが示されました 15。 この研究では、SYNB1618 は全身毒性と関連しておらず、すべての被験者が最後の投与から数日以内に細菌を除去しました。 PKU患者コホートの規模が小さいため、血漿Pheの変化を検出する能力はありませんでしたが、この結果は、より大きなPKU患者コホートで構成される第2相臨床試験におけるSYNB1618のさらなる研究を裏付けるものでした（SynPheny-1; NCT04534842）。 並行して、SYNB1934 が構築され、前臨床試験が行われ、インビトロおよびインビボで SYNB1618 よりも優れた性能を示すことが示されました。 SYNB1934 の第 1 相試験が最近開始されました (NCT04984525)。 SYNB1618 と比較して、SYNB1934 は血漿 Phe 低下の改善、低用量の可能性、またはその他の治療上の利点を提供する可能性があります。

バイオセンサー スクリーニングと PAL 変異体の特性評価のために、Photorhabdus luminescens11 の StlA をコードする遺伝子と StlA 変異体を、低コピー複製起点を含むアンヒドロテトラサイクリン (aTc) 誘導性プラスミド (pSC101) から発現させました。 これらのプラスミドは、自動調節される TetR と構成的スペクチノマイシン耐性カセットをコードしていました。 StlA プラスミドを維持するために、すべての増殖ステップで 100 μg/mL のスペクチノマイシンを提供しました。 バリアント ライブラリの設計と構築のアプローチについては、以下で説明します。 センサー システム (操作された TCA バイオセンサーおよびバイオセンサーによって制御される gfp の発現) は、構成的なアンピシリン耐性マーカーを持つ単一の高コピー プラスミドに含まれていました。 センサープラスミドの維持のために、すべての増殖ステップで 100 μg/mL のカルベニシリンを提供しました。

Escherichia coli Nissle 1917 (EcN) は、German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ Braunschweig、E. coli DSM 6601) から購入しました。 Phe 分解臨床候補株は、EcN 染色体への遺伝子の挿入によって構築されました。 SYNB1618 の構造については以前に説明しました 10。 遺伝子間遺伝子座、malEK、araBC、yicS/nepI、agaI/rsmI、exo/cea、および rhtBC はすべて、適切な挿入部位として同定されました。 これらの遺伝子間領域は、挿入された配列が隣接する遺伝子やプロモーターに極性効果をもたらすことが予想されないように、かなりの長さの DNA によって分離された分岐プロモーターまたは収束オープン リーディング フレームで構成されます。 EcN ゲノムへの染色体挿入は、十分に特徴付けられているラムダレッド組換えアプローチを使用して実行されました 51。 各挿入について、(1) 組換え用の 1000 bp の 5' および 3' EcN ゲノム相同性を含む pKD3 または pKD4 ベースのプラスミドを構築し、続いて (2) 等温法により目的の遺伝子/プロモーターをプラスミドに挿入します。アセンブリ（HiFI DNA Assembly Master Mix、NEB）、（3）PCR によるプラスミドからの挿入フラグメントの増幅（EcN 相同領域およびフリッパーゼ認識ターゲット（frt）部位を含む、その後の抗生物質カセット除去のためのクロラムフェニコールまたはカナマイシン耐性カセットに隣接する）、 Q5 High-Fidelity Master Mix、NEB)、(4) pKD46 によるエレクトロポレーションによる挿入フラグメントの組み換えとその後の pKD46 除去、および (5) pCP20 による抗生物質耐性カセットの除去とその後の pCP20 除去。 SYNB1618 および SYNB1934 の構築に使用されるゲノム挿入用のすべての DNA 配列は、ご要望に応じて入手可能です。

dapA 遺伝子の欠失については、ネステッド プライマーを使用して 2 ラウンドの PCR を実行しました。 PCR の最初のラウンドでは、pKD3 を鋳型 DNA として使用しました。 プライマーは、EcN 染色体の dapA 遺伝子座に隣接する相同性と、frt 部位に隣接するクロラムフェニコール耐性遺伝子を含む dsDNA フラグメントを生成するように設計されました。 2 回目の PCR で使用したプライマーは、1 回目の PCR 産物を鋳型 DNA として使用しました。 pKD46を含むEcNをエレクトロポレーションによりdapAノックアウトフラグメントで形質転換した。 クロラムフェニコール（３０μｇ／ｍｌ）およびジアミノピメリン酸塩（Ｓｉｇｍａ、Ｄ１３７７；１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ寒天上でコロニーを選択した。

すべてのエレクトロポレーションは、エッペンドルフ エポレーター (1.8 kV パルス、ギャップ長 1 mm の電気キュベット) で実行されました。 形質転換細胞を、必要に応じて100μg/mlのカルベニシリンおよび50μg/mlのカナマイシンを含むLB寒天(Sigma、L2897)上のコロニーとして選択した。

フェニルアラニンは VWR (カタログ番号 97062-556) または Sigma (カタログ番号 P2126) から入手し、M9 塩は Fisher (カタログ番号 DF0485-17) から購入しました。 活性化バイオマスを、M9 (6.8 g/L Na2HPO4 + 3 g/L KH2PO4 + 0.5 g/L NaCl + 1 g/L NH4Cl) + 0.5% グルコース + 40 mM フェニルアラニン中で全細胞活性についてアッセイしました。 フェニルアラニン濃度を下げて適合させた最小 M9 グルコース レシピをセンサーベースのスクリーニングに使用しました: 1% グルコース + 13.6 g/L Na2HPO4 + 6 g/L KH2PO4 + 1 g/L NaCl + 2 g/L NH4Cl + 1% LB Lennox + 微量金属 (0.0002% C6H8FeNO7、1.8 mg/L ZnSO4・7 H2O、1.8 mg/L CuSO4・5 H2O、1.2 mg/L MnSO4・H2O、1.8 mg/L CoCl2・6 H2O) + プラスミド維持用抗生物質 + 200 stlA バリアント発現の ng/mL aTc + 基質として 10 mM L-フェニルアラニン。

特定の TCA 応答性 aTF バイオセンサーは、Zymergen 独自のセンサー開発プラットフォームを使用して設計されました。 これは、FACS 上で TCA の存在下で細胞あたりの高い GFP を選択し、TCA の非存在下で細胞あたりのバックグラウンドが低い GFP を選択することによって、設計されたセンサーのライブラリーから濃縮されました。 上位のバイオセンサー候補は、既知の活性レベルのStlA変異体を使用して、生産宿主EcN内の関連リガンドに対するTCAに対する特異性、および生産されたTCAとの相関性についてさらに特徴付けられました（図1b）。

StlA の相同性モデルは、RosettaCM32 を使用して構築されました。 テンプレートは、HHblits および HHsearch52 を使用して Pfam および PDB70 データベースを検索することによって特定されました。 次に、最もスコアの高い 10 個の PDB テンプレートが、RosettaScripts53 とベータ エネルギー関数 54 によって使用され、相同性構造のアンサンブルが構築されました。 200 個のデコイが生成され、最もエネルギーの低いものが選択されました。 この分析で使用されるコードと手順は、GitHub リポジトリ https://github.com/Zymergen/AdolfsenIsabella_NatComm にあります。

標的酵素のライブラリーを設計するために、系統解析、共進化解析、構造解析という 3 つのアプローチを使用しました。

系統解析を実行するために、PSI-BLAST33 を使用して PSSM を生成し (通常、e 値 = 0.01 および反復 = 3 のデフォルト設定を使用)、野生型 StlA 配列の単一置換を評価するために使用されました。 結果として得られる行列には、PSI-BLAST によって返された相同配列セット内のその位置でのアミノ酸の頻度に対応する、タンパク質内のすべての位置で考えられるすべてのアミノ酸のスコアが含まれます。 これらの潜在的な置換をその位置の野生型残基のスコアと比較し、著しく高いスコアの置換 (典型的なカットオフ: z スコア > 2) が PSSM から利用可能な場合、その所定の位置のアミノ酸が選択されました。実験的な検証。

分析を拡張して残基カップリングを含めるために、GREMLIN34 を使用して StlA に対して共進化分析を実行し、すべてのカップリングを分析して最適化しました。 分析によればカップリングが最適ではなかった位置については、最も最適なアミノ酸置換が選択され、実験的にテストされました。

最後に、活性部位を標的とするために、相同性モデル (前のセクションで説明したモデル生成) を使用して活性部位付近の位置を特定しました。 これらの位置が系統解析で観察された場合 (PSSM スコア >0)、実験的検証のためにライブラリに含めました。

このライブラリーは、野生型 StlA と、初期の工学的取り組みでパフォーマンスの向上が実証された 3 つの変異体 (H133M_I167K_V207I、S92G_H133F_Y437N、および A93C_H133M_I167K、いずれも野生型 StlA と比較して活性が 20 ～ 40% 向上しました) の 4 つのテンプレートに組み込まれました。 それぞれ低コピーの aTc 誘導性プラスミド骨格内に含まれる StlA 変異型テンプレートを等モル比で混合して、オリゴベースのライブラリー構築アプローチ用のプラスミドテンプレートを提供しました。 別のプライマー ペア (補足データ) は、インバース PCR55 を使用して標的変異部位でプラスミド全体を増幅する、一体型ゴールデン ゲート反応を通じて各標的変異を導入するように設計されました。 130 個の標的変異について、130 回の個別の PCR (Q5 High-Fidelity Master Mix、NEB) を実行しました。 各反応のサブサンプルをアガロースゲル上で実行して、相対的なバンド強度の定量化を可能にし、これを使用して 130 個の PCR 産物を正規化し、プールしました。 プールした生成物を DpnI で消化し、ゲル精製し、NEB Golden Gate mix (BsaI-v2) を使用して 37 °C で 1 時間環状化し、続いて 60 °C で 5 分間熱不活化しました。 130 個の変異×4 テンプレートのプールされた環状ライブラリーを、NEB のプロトコールを使用して NEB10β エレクトロコンピテント細胞に形質転換しました。 回収した培養物を、形質転換体の一晩の選択のために抗生物質を含むLBに移し、サブサンプルを抗生物質を含むLB寒天プレート上にプレーティングして、ライブラリーが適切にカバーされていることを確認した。 このプロセスをさらに 2 回繰り返し、2 回目のサイクル後に設計された突然変異の 1 つおよび 2 つの組み合わせのコンビナトリアル ライブラリを生成し、3 回目のサイクル後に設計された突然変異の 1、2、および 3 つの組み合わせのコンビナトリアル ライブラリを生成しました。 2 回目と 3 回目のクローニング サイクルでは、一晩の選択培養物からライブラリー プラスミドを精製し、次のラウンドの PCR 突然変異誘発でテンプレートとして使用しました。 3 サイクルのクローニングの後、100 万を超えるメンバーを含む低コピー aTc 誘導性ライブラリーを、高コピー プラスミド上にセンサー システムを含む野生型大腸菌ニッスル (EcN) 宿主株に形質転換しました。

TCA生成およびセンサー応答中のクロストークを低減するために、細胞はマイクロ流体的に生成された油中水滴の中にカプセル化されました。 ライブラリの複雑さを維持するために、十分な量の-80 °C グリセロール保存ストックから、25 mm 試験管内の 10 mL LB+ 抗生物質 (上記「プラスミド」を参照) にライブラリを接種しました。 培養物を飽和するまで一晩〜16時間インキュベートし、その時点で培養物1 mLを17,800×gで1分間遠心分離し、ペレットを等量のろ過したセンサー応答培地に再懸濁しました（上記の「アッセイ培地」を参照）。 洗浄した細胞のOD600をGenesys 20分光光度計で20倍希釈して測定し、細胞を同じ培地でOD600が0.03になるまで希釈した。 OD600 が 0.03 の場合、時間 0 で平均 40 µm の液滴あたり約 1 個の細胞がカプセル化されます。

液滴は、流れ集束マイクロ流体デバイス内で約 3.4 kHz の速度で Sphere Fluidics オイル (Pico-SurfTM 1、NovecTM 7500 中に 2%、ロット番号 031117-1 - 追加の NovecTM 7500 で 1% 界面活性剤に希釈) で生成されました。ガラス上の PDMS チップとして社内で製造されています。 液滴を 1.5 mL エッペンドルフ チューブに収集し、回転させずにスタンディング インキュベーター内で 33 °C で約 16 時間インキュベートしました。 インキュベーション後、十分な量の 1H、1H、2H、2H-ペルフルオロ-1-オクタノール (Sigma) を加え、VWR Galaxy 大臣遠心分離機で約 15 秒間ボルテックスし、約 1 秒間パルス回転させてエマルジョンを破壊し、エマルションを分離しました。有機層と水層。 水層には液滴から放出された細胞が含まれています。 細胞選別の前に、壊れたエマルションからの水相を濾過したリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で100倍に希釈しました。

ProSortTM ソフトウェア バージョン 1.6.0.12 を使用して、サンプルと収集チャンバーを室温に保持し、Bio-Rad S3E セル ソーターで目標イベント速度 1500 イベント/秒で細胞を選別しました。 イベントは、初期容量 0.5 mL LB を含む 5 mL ポリプロピレン スナップ キャップ チューブ (Falcon) に収集されました。 イベントは、3 つのメトリクスを使用してゲートされました。同様のサイズの EcN 細胞を分離するための楕円形の SSC 面積対 FSC 面積ゲート、ダブレットを除外するための FSC 高さ対 FSC 面積ゲート、および GFP 面積 (FITC-A)強いセンサー応答に基づいてセルを選択するためのゲート。 このゲート戦略は補足図 6 に例示されています。選別した体積を、33 °C、220 rpm で一晩回収するのに十分な量の LB Lennox + 抗生物質に希釈しました。 複数の増殖による遺伝的浮動に関する懸念を回避するために、回収された集団からの StlA プラスミドを精製し、その後の選別を行う前にセンサー プラスミドを含む新鮮な EcN に形質転換しました。

標準 96 ウェル プレート (VWR カタログ番号 82050-772) 内の 150 μL LB Lennox + 抗生物質を、StlA バリアント発現プラスミドおよびセンサー プラスミドを含む大腸菌ニッスルのコロニーから接種しました。 これらの前培養プレートを、VWR 多孔質フィルム (VWR カタログ番号 60941-086) で覆われた Incu-Mixer MP インキュベーター (Benchmark Scientific) 内で 33 °C、750 rpm で一晩インキュベートしました。

一晩前培養したものを、ディープウェル 96 ウェル プレート (VWR カタログ番号 89047-264) 内の 1 mL LB Lennox + 抗生物質に 1:100 で接種しました。 プレートを VWR 多孔質フィルムで覆い、Incu-Mixer 内で 33 °C、1500 rpm で 2 時間インキュベートして対数期に達しました。 2 時間後、すべてのウェルを 200 ng/mL aTc (最終濃度、VWR カタログ番号 200002-828) で誘導し、再び VWR 多孔質フィルムで覆った Incu-Mixer に戻し、33 °C、1500 rpm で 4 時間放置しました。 残りのすべてのステップは 4 °C/氷上で実行されました。 4 時間後、プレートを 3214 × g で 10 分間遠心分離しました。 上清をデカントし、ペレットを 250 μL の冷 PBS で洗浄しました。 プレートを再度 3214 × g で 10 分間遠心分離し、デカントしました。 ペレットを 30 μL の冷 PBS に再懸濁しました (細胞ペレットを含む最終約 40 μL)。 これに、40 µL の冷 50% グリセロールを添加し、OD600 ～ 25 の調製物を生成しました。 細胞調製物を冷却した96ウェルPCRプレートに移し、ホイルで覆い、アッセイまで-80℃で保存した。

アッセイでは、活性化バイオマス調製用 96 ウェル PCR プレートのアリコートを 4 °C で解凍し、OD600 = 25 の各活性化バイオマス 4 μL を 96 ウェル PCR プレート全体にアリコートし、アッセイ開始まで氷上で保存しました。 アッセイを開始するには、あらかじめ温めた (37 °C) アッセイバッファー (M9 0.5% グルコース 40 mM フェニルアラニン) 96 µL を 4 µL の活性化バイオマスに加え、混合し、ホイルで覆い、37 °C の静置容器に置きました。インキュベータ。 4 時間後、細胞を 3214 × g、4 °C で 10 分間遠心分離してペレット化しました。 ペレット化後、装置の線形範囲内になるまで水で希釈した後、UV-Star マイクロプレート (Greiner カタログ番号 655801) の吸光度 290 nm で Synergy H1 マイクロプレート リーダーで上清から TCA を定量しました。 プレート内の最終容量は 150 μL でした。 Sigma (カタログ番号 C80857) から購入したトランス桂皮酸を使用して、標準曲線を使用して A290 測定値を TCA (mM) に換算しました。 選択された変異体から生成された TCA 濃度は、高速液体クロマトグラフィーによって確認されました。 野生型に対する倍数（FOWT）の正規化では、変異型 TCA レベルを同じアッセイからの平均野生型 TCA 値で割りました。

上位の PAL 変異体のさらなる特性評価中に、活性化バイオマスは活性アッセイ中に OD600 = 1 にさらに細心の注意を払って標準化されました。 10 mL LB Lennox + 抗生物質を含む培養チューブに、3 mL LB Lennox + 抗生物質を 33 ℃、220 rpm で一晩前培養したものから 1:100 で接種しました。 これらを 33 °C 220 rpm で 2 時間インキュベートし、その時点で 200 ng/mL aTc で誘導し、33 °C 220 rpm のインキュベーターに戻しました。 残りのすべての準備ステップは氷上/4 °Cで行われました。 誘導の 4 時間後、培養物を 15 mL コニカル チューブ (Falcon) に移し、3214 × g で 10 分間遠心分離し、1 mL の冷 PBS に再懸濁し、1.5 mL エッペンドルフ チューブに移しました。 次にそれらを 1 mL の冷 PBS でもう一度洗浄し (微量遠心分離機で 17,800 × g 1 分間)、最後に 300 μL の PBS で再懸濁しました。 OD600 測定はキュベットで実行され、細胞は 300 µL の冷 PBS で OD600 = 50 に正規化されました。 OD600 = 50 の PBS サンプル 300 μL に、最終的な OD600 = 25 になるように 300 μL の冷 50% グリセロールを加えました。アリコートを各株の PCR チューブに分配し、活性化バイオマスアッセイを実行できるまで -80 °C で保存しました。 。

さまざまな pH で実施したアッセイ (図 4b) では、活性化バイオマスを 4 °C で解凍し、M9 0.5% グルコース 40 mM Phe で OD600 = 1 に希釈し、96 ウェルで pH 5、6、7、または 8 に滴定しました。 PCRプレート。 プレートをホイルで覆い、37℃で4時間インキュベートしました。 次に、PCR プレートを 3214 × g 4 °C で 10 分間遠心分離し、上記の「菌株からの TCA 産生に関するプレートベースの活性化バイオマスアッセイ」に記載されているように、290 nm での吸光度によって上清を定量しました。

低pHから回復した後に実行されるアッセイ（図4c）では、活性化バイオマスアリコートを解凍し、96ウェルPCRプレートでpH 5（Pheなし）のM9 0.5％グルコースでOD600 = 1に希釈しました。 プレートを振盪せずに 37 °C で 1 時間インキュベートし、3214 × g 4 °C で 10 分間遠心分離し、PBS で洗浄した後、「プレートベースの活性化バイオマス」に記載されているように、中性 pH での活性化バイオマス活性をアッセイしました。菌株からの TCA 産生のアッセイ」を参照してください。 pH 5 培地を除去する洗浄ステップ中の細胞損失を制御するために、新鮮な活性化バイオマスを 96 ウェル PCR プレートに添加し、pH 5 でインキュベートしたサンプルと一緒に洗浄し、その後、活性化バイオマス活性についてアッセイしました。 これらのサンプルは、図 4c では「コントロール」とラベル付けされています。 FOWT の正規化では、変異体 TCA レベルを同じアッセイからの平均野生型 TCA 値で割りました。

一連の PAL 発現株を EcN で構築しました。これには、染色体上の別の位置に stlA が 1 つ挿入されている株 (2)、同じバックグラウンドで両方の染色体 stlA 遺伝子コピーを含む株、低コピー stlA を持つ株が含まれます。 stlA 発現プラスミド (pSC101 起点) と高コピー stlA 発現プラスミド (pUC 起点) を持つ株です。 これらの株のそれぞれにおいて、同じ stlA コード配列、リボソーム結合部位、および Tc 誘導性プロモーターが使用されたため、株間の唯一の違いは染色体挿入の位置および/または stlA 遺伝子コピー数でした。 株の増殖およびＰＡＬ誘導のために、適切な抗生物質を含む１０ｍＬのＬＢレノックスブロスを入れた５０ｍＬバッフルフラスコに、一晩培養したものを１：１００で接種した。 フラスコをエッペンドルフオービタルシェーカー中、37℃、250rpmで2時間振盪して培養し、培養物を対数増殖期にし、その時点でaTcを200ng/mLのaTc（最終濃度、VWRカタログ番号200002-828）で添加した。 細胞をさらに4時間誘導増殖させた後、5000×gで10分間遠心分離し、ペレットを等量の氷冷PBSに再懸濁した。

全細胞のPAL活性を測定するために、微量遠心分離管中で株を1 mL Pheアッセイ緩​​衝液（M9 0.5%グルコース含有40 mM Phe）中でOD600が0.1になるまで再懸濁し、37℃のヒートブロックに置きました。 サンプルを2時間にわたって30分ごとに取り出し、TCA濃度を上記のようにOD290測定によって決定した。 TCA 生成速度は、経時的に測定された上清中の TCA 濃度から推定されました。

溶解物からの PAL 活性を測定するために、6 mL の再懸濁細胞を 18,000 psi の圧力で Microfluidics™ LV1 Low volume Microfludizer® ホモジナイザーに通しました。 各菌株をホモジナイザーに 3 回通して、完全な溶解を確実にしました。 得られた溶解物を 12,000 × g で 20 分間遠心して、不溶性物質をペレット化しました。 それぞれの清澄なライセートの総可溶性タンパク質濃度を、BCA アッセイ (Pierce、カタログ番号 23227) によって測定しました。 TCA産生速度は、細胞の再懸濁ではなくアッセイ用のPALを提供するために30mgの可溶性タンパク質を使用したことを除いて、上記の全細胞に使用した方法と同様に決定した。

ドデシル硫酸ナトリウム - ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) ゲルは、WT EcN の全細胞と上記の操作された株シリーズを使用して実行されました。 細胞を記載どおりに増殖および誘導した。 各誘導株の全細胞をOD600が0.5になるまで再懸濁し、1×ドデシル硫酸リチウムサンプルローディングバッファー(Invitrogen、カタログ番号NP0007)中で15分間煮沸した。 20 μL 量の各サンプルを 4 ～ 12% ビス-トリススタッキング SDS-PAGE ゲル (Invitrogen、カタログ番号 NP0322) にロードしました。 標準については、タンパク質のサイズを推定するために、iBright Prestained Protein Ladder (Invitrogen、カタログ番号 LC5615) が含まれています。 メーカーの指示に従って、ゲルを MES SDS バッファー (Invitrogen、カタログ番号 NP0002) 中で 200 V で 30 分間泳動し、SimplyBlue SafeStain (Invitrogen、カタログ番号 LC6065) で染色しました。

活性化バイオマスは、上のセクションで説明したように 10 mL 培養チューブから調製し、その後、速度論的パラメーターを決定するために溶解しました。 ライセートを調製するために、解凍したバイオマスサンプルを希釈し、マイクロチップを備えた Branson Digital Sonifier を使用して超音波処理し、ライセートサンプルの可溶性画分を速度論的アッセイに使用しました。 ライセートサンプル中の総タンパク質はブラッドフォードアッセイによって測定され、すべてのサンプルは速度論的アッセイのためにウェルあたり 10 μg の総タンパク質ローディングに正規化されました。 溶解物サンプルを、２倍希釈で４０ｍＭ Ｐｈｅから３９μＭまでの範囲のＰｈｅ濃度を有するＭ９ ０．５％グルコース中でインキュベートした（Ｐｈｅを含まないアッセイ緩​​衝液も対照として含まれた）。 反応速度論的アッセイは、UV-star 96 ウェル マイクロプレート (Greiner) で実行し、37 °C 静的インキュベーションに設定した BioTek Synergy H1 マイクロプレート リーダーを使用して毎分 A290 測定によって TCA を定量しました。 ミカエリス・メンテン モデルのフィッティングは、3 つのバッチ反復からのレート データに対して非線形回帰 (式 V = (Vmax * [S])/(KM + [S]) による R の nls 関数) を使用して実行されました。 モデルの適合例は補足図 7 にあります。非線形回帰で使用される速度 V は、テストされた各 Phe 濃度の活性の最初の 1 時間から計算され、活性は線形のままでした。

すべての菌株を次のように調製した発酵培地で増殖させました: 酵母抽出物 (40 g/L)、K2HPO4 (5 g/L)、KH2PO4 (3.5 g/L)、(NH4)2HPO4 (3.5 g/L)、 MgSO4・7H2O (0.5 g/L)、FeCl3 (1.6 mg/L)、CoCl2・6H2O (0.2 mg/mL)、CuCl2 (0.1 mg/L)、ZnCl2 (0.2 mg/L)、NaMoO4 (0.2 mg/L) )、H3BO3 (0.05 mg/L)、グリセロール (25 g/L)、消泡剤 204 (125 μL/L)。 株の生産は、細胞バンクからのバイアルを解凍し、500 mL Ultra-Yield™ フラスコ (Thomson Instrument Company) 内のジアミノピメリン酸塩 (300 μg/mL) を補充した 50 mL 発酵培地で解凍したバイアル 1 mL を培養することによって開始しました。 OD600 が 10 ～ 15 に達するまで細胞を 375 rpm で振盪しながら増殖させ、その時点で培養物を使用して HyPerforma™ Thermo Scientific 30 L 使い捨て発酵槽内の 24.5 L の培地に開始 OD600 0.000016 で接種しました。 発酵槽は、水酸化アンモニウムを使用して 37 °C、溶存酸素 (DO) 濃度 60%、pH 7 に制御されました。 SYNB1618 では、OD600 が 1.5 で、低酸素環境 (10% DO) を作り出し、イソプロピル β-d-1-チオガラクトピラノシド (IPTG、1 mM) を添加することによって細胞を活性化しました。 この時点で栄養供給も開始し（２７１．７５ｇ／Ｌの酵母抽出物、８６．２７ｇ／Ｌのグリセロールを１５ｍＬ／Ｌｈ）、発酵の終了まで継続した。 IPTGの添加から3.5時間後、栄養供給速度を2倍の30mL/Lhに増加した。 SYNB1934 では、OD600 が約 1.5 で、細胞は IPTG (1 mM) の添加によって活性化され、DO は 30% に維持されました。 この時点で栄養供給も開始し（２７１．７５ｇ／Ｌ酵母抽出物１１．２５ｍＬ／Ｌｈ、８６．２７ｇ／Ｌグルコース）、３．５時間継続した。 3.5 時間後、栄養供給速度を 2.75 時間かけて 2 倍の 22.5 mL/Lh にしました。 両方の菌株について、発酵の最後の 1 時間、L-アラビノースを発酵液に添加しました (最終濃度 10 mM)。 Phe 分解成分を含まない対照株 SYN094 を、定常期に達するまで 30% の安定した DO 含有量を供給する発酵培地中で 5 L バイオリアクター内で増殖させました。 菌株をタンジェンシャルフロー濾過(TFF)によって回収した。

TFFの終了時に、上清を廃棄し、細胞を凍結保護緩衝液(10% wt/vol トレハロース、50 mM Tris、pH 7.5)中に最終濃度150 OD600まで再懸濁した。 配合された細胞懸濁液を使用して 2 mL の琥珀色のガラス製バイアルを充填し、最終含水量が <5% になるまで凍結乾燥しました。 凍結乾燥した材料は 4 °C で保存されました。 乾燥した凍結乾燥粉末をＰＢＳ（Ｑｕａｌｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、１１４－０５６－１０１）で再構成して、凍結乾燥前の体積と一致させた。 この再構成された細胞懸濁液は、活性、生存率を測定するために使用されました。

細菌細胞の生存率を測定するために、再懸濁した細胞を希釈し、SYTOX Green 核酸染色剤 (Life Technologies) で染色しました。 染色された生細胞および死滅細胞を、メーカーのプロトコールに従い、Nexcelom Bioscience Cellometer X2 画像サイトメーターで直接計数しました。

in vitro 胃シミュレーション モデルは、胃酸素濃度、ペプシン分泌、胃 pH など、ヒトへの経口投与の重要な側面をシミュレートするように設計されました。 IVS アッセイは、ヒトの胃の状態をシミュレートするように設計された 96 ウェル マイクロタイター プレート形式でのインキュベーションで構成されます 56。 簡単に説明すると、凍結乾燥した細胞を室温で PBS に再懸濁しました。 細菌細胞濃度は、生存細胞数および/または総細胞数によって決定されました。 細胞のアリコートを 5.0 × 109 細胞/mL で 0.077 M 重炭酸ナトリウム緩衝液に再懸濁しました。 次に、この溶液を等量の 20 mM Phe を含む模擬胃液 56 と混合し、酸素 2% に校正したポリカーボネート製の in vitro 低酸素チャンバー (Coy Lab Products) 内で振盪しながら 37 °C で 2 時間インキュベートしました。 得られた SGF 中の SYNB1618 細胞密度は 2.5 × 109 細胞/mL でした。 PAL 活性を測定するために、SGF アリコートを定期的に収集し、卓上遠心分離機を使用して 5000 × g で 5 分間遠心分離し、続いて液体クロマトグラフィー - タンデム質量分析 (LC-MS/MS) で Phe およびトランスシンナメート ( PBS）。

NHP 研究は、動物福祉法規制の最終規則 (連邦規則集、第 9 編)、人道的なケアと動物の使用に関する公衆衛生政策の該当するすべてのセクションに従って、Charles River Labs (マサチューセッツ州シュルーズベリー) で実施されました。実験動物福祉局の「実験動物」、および米国研究評議会の「実験動物の管理と使用に関するガイド」。 2～5 歳の雄カニクイザル 12 匹 (2.5～4 kg) を使用し、国際認定霊長類飼料 (PMI 栄養、5048) で飼育しました。 NHP 研究に関連する標準的な操作手順は、Charles River Laboratories の施設内動物管理使用委員会によって検討され、承認されています。 コホート内のすべての動物は研究開始時には良好な健康状態にあり、研究の間に少なくとも7日間は洗い流されました。 SYNB1934 と SYN1618 を比較するために 3 つの単回投与研究が実施されました。 各実験日に、6 人の NHP 被験者に SYNB1618 または SYNB1934 を投与しました。上に示したデータは 3 回の実験を組み合わせた結果です。

動物は、投与前日（１日目）に一晩絶食させられ、１日目の手順の間中、最大２４時間を超えない範囲で絶食させた。 1日目の朝、静脈穿刺により各サルからベースライン血液サンプルを採取した。 動物は投与のために一時的に拘束されたが、鎮静はされなかった。 凍結乾燥細菌を再懸濁し、5 mL の 0.36 M 重炭酸ナトリウム、7.7 mL の 20 mg/mL 1-フェニル-D5-アラニン (C/D/N Isotopes Inc.) とともに各動物に 1011 生細胞用量で経口投与しました。 、および６．１ｍＬの５００ｇ／Ｌペプトンペプティックダイジェスト（Ｓｉｇｍａ）。 さらなる分析のために、血漿と蓄積尿が収集されました。 投与後、動物をケージに戻し、清潔な採尿パンを各ケージの底に置きました。 全体として、最初の投与から 6 時間後に累積尿量を測定および記録し、尿サンプルを -80 ℃で保存しました。 投与後 0.5、1、2、4、および 6 時間後に血液サンプルを収集し、血漿を調製して -80 °C で凍結しました。 代謝産物の濃度は、LC-MS/MS 検出を備えた誘導体化アッセイを使用して定量されました。

TCA、d5-TCA、HA、および d5-HA の定量は、Thermo TSQ Quantum Max トリプル四重極液体クロマトグラフィー - タンデム質量分析 (LC-MS/MS) システムの標的多重反応モニタリング (MRM) モードを使用して実行されました。 使用した標準物質は、trans-桂皮酸 (Acros、158570050)、trans-桂皮酸-d5 (CDN Isotopes、D-5284)、馬尿酸 (Sigma、112003)、および馬尿酸-d5 (CDN Isotopes、D-5588) でした。 。

標準は、次の濃度で水中で調製されました: 0.032、0.16、0.8、4、20、100、および 250 μg/mL。 サンプルは分析前に –80 °C で保存されました。 尿サンプルは、サンプル処理前に水で 40 倍に希釈されました。 尿中 HA および d5-HA (0.32、1.6、8、40、200、1000、および 2500 μg/mL) を分析する場合、クレアチニン (Sigma、60275) を標準混合物に添加しました。 96 ウェル プレートに、10 µL の標準物質とサンプルを移し、続いて 90 µL の誘導体化溶液 (50 mM の 2-ヒドラジノキノリン、ジピリジルジスルフィド、およびトリフェニルホスフィンを含むアセトニトリルと 1 µg/mL の同位体標識内部物質を含む) を添加しました。標準 13C9-15N-Phe (Cambridge Isotopes、CNLM-575-H-PK) および d5-クレアチニン (CDN Isotopes、D-7707) プレートを ThermASeal ホイルでヒートシールし、混合し、60 °C でインキュベートしました誘導体化サンプルを 1 時間 1 時間遠心分離し、誘導体化サンプルを 3200 × g で 5 分間遠心分離しました。別のプレートに誘導体化サンプル 20 μL を移し、さらに 0.1% ギ酸水/アセトニトリル溶液 180 μL ( 140:40). 使用した注入量は 10 μL、実行時間は 0.5 mL/分の流速で 4.25 分でした。移動相 A は水中の 0.1% ギ酸、移動相 B は 0.1% ギ酸でしたアセトニトリル/イソプロパノール (90:10) 中の酸 クロマトグラフィー分離は、Phenomenex C18 カラム (3 μm、100 × 2 mm) を使用し、次の勾配で実行しました: 0 ～ 0.5 m で 10% B、0 ～ 0.5 m で 10 ～ 97% B 0.5 ～ 2 m、2 ～ 4 m で 97% B、4 ～ 4.25 m で 10% B。 タンデム質量分析には、ポジティブモードでの多重反応モニタリングが使用されました。 以下の質量転移を定量のためにモニターしました:TCA (290/131)、d5-TCA (295/136)、HA (321/160)、d5-HA (326/160)、およびクレアチニン (114/44)。

グループ平均、標準誤差/偏差、線形回帰は Microsoft Excel で計算されました。 p 値を計算するには、対応のないスチューデント t 検定、一元配置分散分析とそれに続く Tukey の多重比較検定、または Welch の ANOVA と Dunnett の T3 多重比較検定を Graphpad Prism または Excel で実行しました。 曲線下の面積は、Graphpad Prism を使用した線形台形法で計算され、ベースラインは該当する各実験の時間 0 での平均値によって設定されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

この研究中に生成または分析されたすべてのデータは、この公開された論文 (および付随する補足情報ファイル) に含まれています。 フローサイトメトリーデータ (図 1b) は、ソースデータの圧縮フォルダー「Fig1b_fcs_files」に .fcs ファイルとして提供されます。 他のすべてのデータは、ファイル「Source data.xlsx」で提供されます。 E. coli Nissle 株 1917 は DSMZ から入手し、SYNB1618 および SYNB1934 の生成につながる遺伝子操作された株の構築に使用されました。 この原稿に記載されているすべての株は、同じ親の背景に由来しています。 この原稿に記載されている改変株は、MTA の対象として入手可能であり、対応する著者に連絡することで要求できます。 SYNB1618 の完全なゲノム配列は、BioProject ID: PRJNA482064 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/?term=PRJNA482064) で入手できます。 SYNB1934 の完全なゲノム配列は、BioProject ID: PRJNA749270 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/?term=PRJNA749270) で入手できます。 ソースデータはこのペーパーに付属しています。

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著者らは、このプロジェクト全体を通して、そしてこの原稿の準備中にフィードバックをくれた Caitlin Allen、Mark Charbonneau、Caroline Kurtz、Dave Hava に感謝します。

ジュニアあたり旅

現在の住所: Novo Nordisk Research Center Seattle Inc、530 Fairview Ave N、シアトル、ワシントン州、98109、米国

リンドン・ウェン

現在の住所: Sana Biotechnology、1 Tower Place Suite 500、South San Francisco、CA、94080、USA

Zymergen Inc. (旧 enEvolv Inc.)、100 Acorn Park Drive、Cambridge、MA、02140、USA

クリスティン・J・アドルフセン、イゾルデ・カリハン、パー・ジュニアグライセン、ジェームズ・スプーナモア、ローレン・E・フィッチ、リンドン・ウェン、カール・J・ワイル、ジェイ・H・コニチカ、アダム・G・ローレンス

Synlogic Inc、301 Binney St、Cambridge、MA、02139、米国

キャサリン・E・モナハン、ムニラ・モミン、メアリー・ジョーン・カスティージョ、ローレン・ルノー、テオデリンダ・ミラベラ、アンドレス・アビン＝フエンテス、ヴィンセント・M・イザベラ

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KJA、AGL、VMI、AA がプロジェクトを監督しました。 KJA、IC、VMI、AA がデータを分析しました。 JSはセンサー発見を実施しました。 PG は酵素エンジニアリングを監督し、すべての PAL 設計に関する推奨事項を提供しました。 LEF は、変異を導入するために必要なプライマーをコンピュータで設計し、KJA によってコンビナトリアル PAL ライブラリを構築しました。 センサーベースのスクリーニングは、KJA、LW、および IC によって実行されました。 プレートベースの活性化バイオマスアッセイおよび変異体配列決定は、KJA、IC、および CWLEF によって実行されました。 PyMOL図生成を実行しました。 AGL、PG、JS、JHK が監督を行いました。 CM は候補株の構築と in vitro 実験の実行/分析を担当しました。 AA と MM は、菌株の発酵と製剤化を担当しました。 MJC は質量分析を実施し、分析しました。 TM と LR は NHP 研究の実施を監督しました。

ヴィンセント・M・イザベラへの通信。

著者は次のような競合する利益を宣言します。すべての著者は Synlogic, Inc. または Zymergen, Inc. の株式を保有しており、出版を通じて金銭的に利益を得たり損失したりする可能性があります。

査読情報 Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた匿名の査読者に感謝します。 査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

アドルフセン、KJ、カリハン、I.、モナハン、CE 他。 バイオセンサーを利用した酵素工学によるフェニルケトン尿症の合成生細菌治療薬の改良。 Nat Commun 12、6215 (2021)。 https://doi.org/10.1038/s41467-021-26524-0

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受信日: 2021 年 6 月 14 日

受理日: 2021 年 10 月 12 日

公開日: 2021 年 10 月 28 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-021-26524-0

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